维生素E是一种重要的脂溶性化合物,它是维持机体正常代谢和机能的必需维生素,具有清除自由基、抗癌、抗心血管疾病、抗衰老等功能。人体不能自行合成维生素E,必须从外界摄取。维生素E包括四种生育酚和四种生育三烯酚,相比生育酚,生育三烯酚具有更好的降低胆固醇、抗氧化、抗癌、抗炎症和心脏保护等功能。天然维生素E只存在于光合生物中,如藻类、蓝藻和绿色植物。市面上的天然维生素E主要从植物油脱臭馏出物中提取,但其含量低、来源有限、且分离难度大,导致生产成本高,难以满足日益增长的市场需求。而化学合成的维生素E,是外消旋的α-生育酚,生物活性较低,主要用作饲料添加剂。本研究基于合成生物学理念,以安全、高效的酿酒酵母作为底盘细胞,参照光合生物中维生素E的合成途径,结合酿酒酵母内源的莽草酸途径和甲羟戊酸途径(MVA),构建产维生素E的酿酒酵母工程菌株。首先,从拟南芥、蓝藻、烟草等光合生物中克隆一系列合成维生素E的关键基因,以EGFP作为报告基因,初步筛选可以在酿酒酵母中异源表达的酶,并结合密码子优化和产物检测,获得5个具有催化活性的关键酶,分别为HPPD,syHPT,MPBQMT,TC和γ-TMT。然后利用课题组之前构建的pUMRI系列组装载体,将这五个途径基因逐步整合到过表达tHMG1和CrtE并敲除GAL80的酿酒酵母菌株YS40中,构建出能够合成γ-生育三烯酚和α-生育三烯酚的重组酵母菌株YS-16,测得γ-生育三烯酚的产量为172.9μg/g干重,α-生育三烯酚为71.3 μg/g干重。为了进一步提高MPBQMT,TC和y-TMT的表达水平和催化效率,对这三个拟南芥来源的酶进行叶绿体转运肽的预测和切除,构建得到优化菌株YS-16C,其总生育三烯酚的产量提高了 1.59倍,其中γ-生育三烯酚的产量为395.2 μg/g干重,α-生育三烯酚为236.1μg/g干重。在此基础上,进一步过表达合成途径中的限速酶syHPT,TC和γ-TMT,构建出高产菌株YS-356C,相比出发菌株YS-16,其总生育三烯酚产量提高了 7.54倍,达到2.09 mg/g干重,其中γ-生育三烯酚的产量为1407.9μg/g干重,α-生育三烯酚为677.4μg/g干重。同时,结合上游莽草酸途径和MVA途径的优化,并增加内源SAM的供应,通过综合调控,进一步提高生育三烯酚的产量。这是首次在非光合生物中实现γ-生育三烯酚和α-生育三烯酚的异源合成,通过生物发酵的方式合成天然维生素E,为天然维生素E的生产提供新的思路和方法。