高效拮抗禾谷镰刀菌的NF001筛选鉴定及其生防机理研究

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禾谷镰刀菌是一种引起小麦患赤霉病的主要病原真菌,侵染小麦麦穗后会分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素,使小麦的产量和品质降低。目前,防治小麦赤霉病的主要手段是加强田间管理、培育抗性品种、使用化学农药以及采用生物菌剂进行防治等。但因抗性品种的培育需要的周期长,化学农药容易导致抗药性,加大用量会增加污染环境。因此,生防防治病害的研究和应用越来越受到人们的青睐。本实验以湖北某地种植的小麦麦粒为材料,筛选到一株高效拮抗禾谷镰刀菌,经形态学和分子生物学鉴定,确定该菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli),编号NF001。NF001对12种植物病原真菌都有抑制作用,其中拮抗禾谷镰刀菌的抑菌率高达64.52%。对NF001拮抗禾谷镰刀菌的条件进行了优化,测定了p H、温度、NF001与禾谷镰刀菌距离、以及摇瓶培养方式等条件,NF001对禾谷镰刀菌的抑制率。实验表明:p H 5时,抑制率最高,达到74.3%;在温度26℃~29℃内,抑制活性最高;当NF001与禾谷镰刀菌的距离为1.5 cm之间时,抑菌活性最大,达到62%;摇瓶2 d静置3 d的培养方式,20%发酵上清液抑菌活性比摇瓶5 d的培养方式得到的发酵上清液抑菌活性高12.1%。研究了NF001对禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发及其产生DON的影响。实验表明:NF001处理禾谷镰刀菌12 h后,菌丝扭曲畸形,原生质体发生凝结,菌丝断裂和细胞壁瓦解,菌丝生长受到抑制。当NF001的菌浓度在高于5×105CFU/m L时,NF001完全抑制禾谷镰刀菌孢子萌发,当菌浓度为5×104CFU/m L时,NF001可以和禾谷镰刀菌共生。NF001菌液处理禾谷镰刀菌浸染过的麦粒,15 d后,测定麦粒中DON,发现含量降低了58%。研究了NF001拮抗禾谷镰刀菌的机理。通过采用溶剂萃取、硅胶柱层析、薄层层析、高压液相色谱、LC-MS、核磁共振等方法,对NF001拮抗禾谷镰刀菌的物质进行了分离纯化和鉴定。经LC-MS分析,纯化后的样品中主要有二肽His-His、四肽Ala-Phe-His-Lys、Hydroxypromazine、毒黄素、环二肽pro-leu、C16 Sphinganine Hexadecasphinganine等几种物质。其中纯化的毒黄素具有很好的抑菌效果。另外,二肽His-His、环二肽pro-leu不能抑制禾谷镰刀菌,但是可以促进毒黄素对禾谷镰刀菌的抑菌活性。毒黄素对禾谷镰刀菌的最小抑菌浓度为256 ug/m L。在优化NF001产生毒黄素的条件实验中,发现,禾谷镰刀菌与NF001共培养,会导致NF001的抑菌活性和毒黄素含量降低。当NF001菌体在摇瓶2 d静置3 d的培养方式下,NF001产生生物膜的量提升了,产生毒黄素的量也得到显著增加。研究了NF001菌液在冬小麦禾谷镰刀菌防治上的应用。实验表明:在小麦的盆栽实验中,喷施NF001后,小麦麦粒中DON含量降低了1155 ug/m L,降低率达84%,病情指数降低了25.1%;同时对小麦的株高、百粒重、穗长、穗重都有不同程度地增加。在小麦的田间实验中,喷施NF001菌液到小麦上后、跟空白对照、阴性对照相比,小麦DON含量分别降低了1324.9 ug/m L、168.8ug/m L,相应地病情指数分别降低了36.14%、13.81%。喷施NF001组的小麦比不施肥组的小麦分蘖数、株高、亩产量、穗长、穗重、鲜重、有效穗数也都有不同程度地增加。实验表明,NF001对小麦不仅有促生作用,而且对禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病有较好的防治作用,具有作为生物防治菌株的潜力。
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