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目的目前,慢性髓系白血病(CML)由于酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的使用可以得到很好的治疗,但仍存在达到完全分子学缓解的患者停药后复发,TKIs耐药等问题,这些都不能被现行的治疗方式控制。因此,寻找BCR/ABL之外治疗靶点的问题还亟待解决。肿瘤坏死因子α(TNFα)在肿瘤的发生发展中起到重要的作用,其被发现能够促使慢性髓系白血病干细胞生存,但其中的作用及机制研究还不深入。本研究利用基因编辑技术CRISPR-cas9,建立背景清晰、同源对照的TNFα敲除人类慢性髓系白血病细胞模型。利用该模型研究TNFα在CML的效应及机制。方法本研究中,我们针对人类TNFα基因,挑选合适的靶点,利用CRISPR-cas9技术设计基因编辑工具。将工具质粒转染入人类慢性髓系白血病细胞系K562中,利用其表达后的酶切效应实现基因敲除。通过克隆化分选和一代测序,挑选出发生基因突变的细胞株。利用RT-PCR和Western-blot方法检测突变克隆在m RNA和蛋白水平上的变化。将突变克隆株扩增后和野生型细胞进行对比,观察其在体外和体内的生物学效应及分泌微泡能力,并对TNFα缺失及野生型细胞进行RNA-seq测序,通过生物信息学分析初步探讨其作用机制。结果成功构建出对TNFα有切割效应的CRISPR-cas9工具质粒,并获得超过30株TNFα基因缺失突变的K562细胞克隆株。在最可能发生脱靶效应的25个位点检测,并未发现突变。基因突变克隆在m RNA和蛋白表达水平上均较野生型下降,且敲除过程没有对BCR/ABL融合基因造成影响。TNFα基因突变的克隆与野生型对照相比,在伊马替尼的作用下,凋亡增加;增殖能力下降,集落形成能力受损。在裸鼠皮下成瘤试验中,突变克隆成瘤的速度和大小均下降。突变克隆的微泡分泌质量与野生型并无差异。测序发现STAT5A信号明显受抑,且与之相关的促癌mi RNA明显下调。结论运用基因编辑技术CRISPR-cas9构建基因敲除的人类细胞模型,背景干净,方法简便,敲除效果可靠。TNFα在慢性髓系白血病细胞中有维持生存,促进增殖的作用,其作用可能是通过改变STAT5A及其相关的mi RNA的表达实现的。