论文部分内容阅读
目的:胃癌是消化系最常见的恶性肿瘤之一,肿瘤转移与复发是其主要死亡原因。赖氨酰氧化酶2(lysyl oxidase-like 2 protein,LOXL2)是赖氨酸氧化酶(LOX)家族的成员之一,在肿瘤细胞中表达增高,与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移过程密切相关。本研究以胃癌患者及体外培养的胃癌细胞系为研究对象,检出胃癌组织及胃癌细胞中LOXL2表达情况、与肿瘤临床病理特征的关系及预后意义,并进一步探讨LOXL2与胃癌增殖、侵袭迁移的关系。方法:免疫组化法检测100例胃癌组织、癌旁组织中LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达情况;采用RT-PCR方法及蛋白印迹技术检测胃癌细胞株BGC823、胃上皮细胞株GES-1中LOXL2 m RNA和蛋白表达;人工合成针对LOXL2的si RNA,并转染胃癌细胞株BGC823;MTT法检测转染前后BGC823细胞的抑制率;流式细胞术检测BGC823细胞的细胞周期分布变化;应用Transwell实验、划痕实验检测BGC823细胞侵袭、迁移能力;荧光定量PCR和Weatern blot检测转染前后胃癌细胞株BGC823中PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9 m RNA和蛋白表达变化。结果:1胃癌组织中LOXL2表达的临床意义及与肿瘤增殖、侵袭的关系1.1 LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表达及与胃癌临床病理特征的关系在胃癌组织中LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显高于癌旁组织(均P<0.05);胃癌组织中LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度间情况无关,无显著性差异(均P>0.05),LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期间具有相关性,有显著性差异(均P<0.05)1.2 LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达与患者生存期的关系根据胃癌组织中蛋白表达情况,LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的阳性表达患者生存期均较阴性表达患者的生存期低,表达阳性和阴性患者生存之间存在显著差异(均P<0.05)。1.3胃癌组织中LOXL2、PCNA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达之间的相关性在胃癌组织中,LOXL2蛋白表达与PCNA、Cyclin D1蛋白表达均呈正相关性(r=0.279,0.287;均P<0.05),LOXL2蛋白表达与MMP-2、MMP-9蛋白表达均呈正相关性(r=0.380、0.310;均P<0.05),PCNA蛋白表达与Cyclin D1蛋白表达呈正相关性(r=0.270,P<0.05)。MMP-2蛋白表达与MMP-9蛋白表达呈正相关性(r=0.545,P<0.05)MMP-2蛋白表达与PCNA、Cyclin D1蛋白表达之间均无明显相关关性(r=0.084、0.102;均P<0.05),MMP-9蛋白表达与PCNA、Cyclin D1蛋白表达之间均无明显相关关性(r=0.089、0.149;均P<0.05)。2抑制LOXL2表达对胃癌细胞增殖能力的影响2.1 LOXL2在不同细胞株中mRNA及蛋白的表达:在人胃癌细胞株BGC823中LOXL2 m RNA及蛋白表达均明显高于胃上皮细胞株GSE-1,具有明显统计学意义(P<0.05)。2.2 LOXL2-siRNA转染BGC823胃癌细胞对LOXL2表达的影响:LOXL2-si RNA转染BGC823细胞后转染24 h后,细胞中LOXL2基因表达受到明显抑制,m RNA和蛋白表达分别下降90.47%和89.40%,而转染阴性对照组si RNA后m RNA和蛋白水平均无明显改变(P>0.05)。2.3 LOXL2-siRNA干扰LOXL2对胃癌BGC823细胞增殖的抑制作用MTT实验观察LOXL2-si RNA对BGC823细胞增殖活性的影响。结果显示,转染LOXL2-si RNA的BGC823细胞增殖活性呈时间-剂量依赖性下降(P<0.05)。2.4 LOXL2-si RNA干扰LOXL2对胃癌BGC823细胞周期影响LOXL2-siRNA转染BGC823细胞48 h之后,BGC823细胞中G0/G1期细胞比例明显高于阴性组(P<0.05),S期细胞的比例明显低于阴性组(P<0.05).转染阴性对照si RNA组BGC823细胞中G0/G1期及S期细胞比例与阴性组相比无明显变化(P>0.05)。2.5 LOXL2-siRNA干扰LOXL2对BGC823细胞增殖相关基因表达的影响LOXL2-si RNA-2转染BGC823细胞48 h后检测增殖相关基因,LOXL2-si RNA组细胞PCNA、Cyclin D1 m RNA及蛋白表达较阴性组明显降低(均P<0.05)。转染阴性对照si RNA组BGC823细胞中PCNA、Cyclin D1m RNA及蛋白表达与阴性组相比无明显变化(P>0.05)。3抑制LOXL2基因对胃癌细胞侵袭能力的影响3.1 LOXL2-siRNA干扰LOXL2表达对BGC823细胞迁移的影响采用划痕实验观检测LOXL2-si RNA对BGC823细胞水平迁移能力影响。结果显示,转染LOXL2-si RNA的BGC823细胞迁移率较阴性组显著减慢(P>0.05)。3.2 LOXL2-siRNA干扰LOXL2表达对BGC823细胞侵袭的影响通过transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化,结果表明,转染LOXL2-si RNA的BGC823细胞侵袭能力较阴性组显著下降(P>0.05)。3.3 LOXL2-si RNA对BGC823细胞侵袭相关基因表达的影响LOXL2-si RNA-2转染BGC823细胞48 h后检测侵袭相关基因,LOXL2-si RNA组细胞MMP-2、MMP-9 m RNA及蛋白表达较阴性组明显降低(均P<0.05)。结论:1胃癌组织中LOXL2表达上调,且LOXL2的表达与与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期间具有相关性,LOXL2是胃癌的预后因子,高表达LOXL2的胃癌患者预后较差。2 LOXL2可通过上调PCNA、Cyclin D1的表达促进胃癌细胞的增殖。3 LOXL2可通过上调MMP-2、MMP-9的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭,对胃癌进展有重要作用。