论文部分内容阅读
慢性酒精中毒性肌病(Chronic alcoholic myopathy,CAM)是由于长期酗酒引起的一种肌肉病,在嗜酒者中发病率约40%-60%,临床主要表现为肌无力、肌痛和肌萎缩,严重影响患者的生活质量。然而对其发病机制的研究却远远较酒精性肝病、酒精性心肌病为少。有资料表明核因子κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的激活在一些肌病肌萎缩中发挥重要作用,本实验旨研究在慢性酒精性肌病的发病过程中这些因子是否有表达和产生影响。若能证明这些因子在酒精性肌病发病中发挥作用,则可以通过控制其生物学活性治疗该病,这对于慢性酒精性肌病发病机理的研究和防治有着重要意义。目的:本实验旨在建立大鼠慢性酒精中毒性肌病模型的基础上,动态观察NF-κB及MMP-2、MMP-9在酒精中毒性肌病发展中的表达、变化情况,探讨其在慢性酒精中毒性肌病发病过程中的作用,从基因和蛋白水平进一步阐述该病发病机制,为慢性酒精中毒性肌病的临床防治提供理论依据,同时对于其他代谢性肌病的研究也提供一个平台。方法:(1)选健康SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠建立慢性酒精中毒性大鼠肌病模型,观察酒精灌胃前后大鼠体重、行为学变化及肌肉组织病理改变。(2)实验组用酒精给大鼠灌胃,对照组用含与酒精体积相等的生理盐水灌胃,两组均喂饲改良的全营养高脂饲料,于12周及18周后,取后肢肌肉,在分离出腓肠肌、比目鱼肌、跖肌后,将各类肌肉均分别地制备成冰冻切片和石蜡切片,经组织化学染色确认成模。(3)采用RT-PCR和Western blot及免疫组化的方法分别检测不同时期的大鼠骨骼肌中核因子κB、MMP-2、MMP-9的表达;采用明胶酶谱的方法检测实验组大鼠早、中、晚期腓肠肌、比目鱼肌、跖肌MMP-2、MMP-9活化、分泌情况;天狼猩红-偏振光法检测大鼠骨骼肌间质纤维增生及成分改变.结果:(1)酒精染毒后,II型肌纤维较I型肌纤维病理损害更严重,酒精染毒大鼠出现了肌纤维变性、坏死,肌纤维萎缩呈三角形、条形或不规则形改变,炎细胞浸润和肌间结缔组织增生等典型的病理改变。(2)RT-PCR结果显示随着酒精摄入量的增多,NF-κB和MMP-9的表达水平逐渐增高,尤其是在腓肠肌和跖肌,更为明显,MMP-2的表达在灌酒过程中升高不明显,但停酒后表达升高。(3)免疫组化结果显示:正常对照组骨骼肌细胞基本无NF-κB表达,实验组骨骼肌细胞可见胞核及胞质大量NF-κB表达。(4)Western blot检测结果显示NF-κB和MMP-9表达水平逐渐增高,酒精能够激活和促进NF-KB的表达,与RT-PCR结果相似,停酒后MMP-2的表达升高。(5)天狼猩红-偏振光法提示在实验组骨骼肌间质纤维结缔组织明显增多尤其是在跖肌,以Ⅰ和Ⅲ型胶原增生为主,Ⅰ型胶原增生更为明显,Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比值增高。(6)明胶酶谱实验提示酒精灌胃组中晚期腓肠肌、跖肌MMP-9活性型、前体、中间型表达均增高,MMP-2在停酒后表达上升。结论:(1)NF-κB表达的增高与肌病的发生密切相关,提示NF-κB的改变可能在慢性酒精性中毒性肌病炎症反应和骨骼肌蛋白水解等病理过程中起重要作用。(2)MMP-9的增高可能参与了骨骼肌间质纤维增生及其构成的改变(Ⅰ和Ⅲ型增多,Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比值增高),诱导炎性细胞浸润,加重慢性酒精中毒性肌病的发生发展。(3)MMP-2的表达主要与慢性酒精中毒性肌病的恢复有关。