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原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma, PHC)是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的癌变,以肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)最常见,在我国恶性肿瘤死亡率居第二位。临床上的治疗一般视手术、放疗、化疗为三大支柱,虽然手术切除的疗效是最好的,但是接受诊治的HCC患者绝大多数已属中晚期,失去手术时机。同时化疗及放疗疗效不佳,且有一定的禁忌。因此研发新的天然、低毒、高效的临床抗HCC药物以及寻找新的抗HCC分子靶点成为当今研究的热点。芹菜素(apigenin)是天然存在的一种黄酮类化合物,广泛存在于多种水果、蔬菜(包括芹菜)、豆类、橘子、茶叶、小麦牙和一些调味品中。研究表明,芹菜素可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡而抑制多种恶性肿瘤(食管癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌等)细胞的生长,并且具有天然、低毒、高效的特点。最新的研究表明,芹菜素通过诱导凋亡及诱导细胞周期阻滞于G2/M期而抑制肝癌细胞的生长,但对于其具体的分子机制仍不是很清楚。本课题的总体研究思路为：选择肝癌细胞株Huh-7作为研究对象,首先通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆形成实验、流式细胞仪(FACS)以及裸鼠成瘤实验检测芹菜素的抗HCC活性；然后进一步通过人全基因组cDNA芯片技术分析芹菜素作用前后差异表达的基因；最后再通过qRT-PCR、Western-blot技术选择性验证芯片分析结果,将为进一步探讨芹菜素对Huh-7细胞毒性的具体分子机制提供理论依据。第一部分芹菜素在体内及体外对肝细胞癌Huh-7生长的抑制作用目的：1、研究芹菜素在体外对Huh-7细胞生物学活性的影响(细胞增殖、细胞克隆形成,细胞周期及细胞凋亡)。2、研究芹菜素在体内对肝细胞癌Huh-7移植瘤生长的抑制作用。方法：1、MTT法绘制生长曲线,观察不同浓度芹菜素对Huh-7细胞生长的影响。2、通过平板克隆形成实验检测不同浓度芹菜素对Huh-7细胞克隆形成能力的影响。3、采用PI染色法,流式细胞术检测不同浓度芹菜素对Huh-7细胞周期分布的影响。4、采用Annexin V-FITC/PI染色法,流式细胞术检测不同浓度芹菜素对Huh-7细胞凋亡状态的影响。5、通过动物模型观察芹菜素对裸鼠人Huh-7移植瘤肿瘤体积的影响并通过HE染色在显微镜下观察其病理学变化。结果：1、从生长曲线可以看出,芹菜素对Huh-7细胞的生长有显著的抑制作用,并随着药物浓度的增加,其抑制作用显著增强,各组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。2、平板克隆形成实验显示：不论从克隆的大小还是克隆的数目,芹菜素处理组均较对照组明显下降,差异具有显著性(P<0.001)。3、芹菜素处理Huh-7细胞后细胞周期分布发生改变,主要表现在G2/M期细胞增加、G0/G1期细胞减少,细胞周期阻滞于G2/M期,随着药物浓度的增加,这种周期阻滞作用越显著,各组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。4、凋亡检测实验发现芹菜素可诱导细胞凋亡,并呈剂量依赖性,各组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。5、芹菜素处理的裸鼠肿瘤体积较未用芹菜素处理组明显缩小(P<0.05),HE染色可见芹菜素处理组裸鼠肿瘤组织明显的坏死。结论：芹菜素通过阻滞细胞周期于G2/M期、降低G0/G1期细胞比例以及诱导细胞凋亡而抑制体内体外肝细胞癌Huh-7的生长。第二部分芹菜素抑制肝细胞癌Huh-7作用的分子机制研究目的：初步探讨芹菜素抑制肝细胞癌Huh-7作用的分子机制。方法：1、通过人全基因组cDNA芯片技术分析芹菜素作用前后Huh-7细胞基因表达差异。2、采用qRT-PCR、Western-blot技术选择性验证基因芯片结果。结果：在41000个基因中,1764个基因的表达发生改变。其中1336个基因显示上调(≥2倍),428个基因显示下调表达(≤0.5)。在这些差异表达的基因中,大多数与核酸结合、转运、接触和酶调节活性、转录调节、细胞骨架结构和粘附、信号转导、代谢、凋亡以及免疫反应等相关。其中代谢相关基因SLC27A3上调27.69倍,转录相关基因OVOL1上调6.23倍,OTP基因上调5.53倍,抑癌基因ZDHHC2上调5.10倍,细胞信号转导相关基因BMPRIA上调5.09倍,免疫反应相关基因IL-4R下调了81.1%,泛素依赖性蛋白分解代谢相关基因USP18下调了80.4%。qRT-PCR、Western-blot选择性验证结果与芯片结果相符。进一步分析细胞周期及凋亡相关功能性基因的表达差异,我们发现芹菜素上调了部分抑制细胞周期进程的基因,同时也下调了部分促进细胞周期进程的基因。其总体作用趋势为抑制细胞周期进程。结论：芹菜素可能通过调节多种基因如代谢相关基因SLC27A3,转录相关基因OVOL1和OTP,抑癌基因ZDHHC2,细胞信号转导相关基因BMPRIA,免疫反应相关基因IL-4R,泛素依赖性蛋白分解代谢相关基因USP18和一些细胞周期及凋亡相关功能性基因等的表达而抑制体内体外肝细胞癌Huh-7的生长。