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前言人脑胶质瘤是一种恶性度高的中枢神经系统疾病,术后的化疗是目前治疗胶质瘤必要手段之一。但由于胶质瘤毛细血管形成的血肿瘤屏障的存在,选择性地转运化疗药物到达脑肿瘤组织一直是一个难题。近年来国内外研究表明,经脑毛细血管内皮细胞上的内源性受体介导的药物转运可能是脑内药物转运最有效的方法之一。白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor,DTR),也称作肝素结合表皮生长因子的膜结合前体(pro heparinbinding-epidermal growth factor,proHB-EGF),是一个含有206个氨基酸的跨膜蛋白,它可以与白喉毒素特异性结合,通过受体介导的内吞作用使其进入细胞。DTR在平滑肌细胞,血管内皮细胞,血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)上均有表达。在疾病,如中风、脑肿瘤的条件下,DTR在BBB中的表达大幅度上调;已经有实验表明,DTR蛋白在许多肿瘤组织中高表达,但在人脑胶质瘤中是否也有表达并未见文献报道。研究表明,白喉毒素的无毒突变体—CRM197,能够作为一种安全有效的人类疫苗而使用。在对白喉毒素敏感的豚鼠的研究中发现,DTR在豚鼠的脑血管内皮细胞和胶质细胞中表达,并检测到CRM197载体蛋白可以安全有效地转运大分子的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,40kD)通过BBB,这充分证实它可以作为一种安全有效的载体,介导大分子物质经DTR进行跨细胞转运。上述结果使我们相信,DTR介导的跨细胞转运可能成为一种更安全有效的脑内大分子药物的选择性转运途径,从而达到治疗肿瘤的目的。本研究采用脑胶质瘤患者术后肿瘤组织标本,通过测定脑胶质瘤组织中DTR的表达水平,与其病理级别相比较,分析脑胶质瘤DTR的表达水平与其病理级别的相关性,为DTR介导的药物转运方法应用于临床上脑肿瘤的化疗提供实验依据。材料和方法一、实验材料(一)标本2007年7月到2008年7月间,从中国医科大学附属第一医院神经外科手术切除的脑胶质瘤中,获得32例新鲜的组织标本。同时收集3例脑挫裂伤手术获得的正常脑组织标本作为对照组。32例患者中,男18例(56%),女14例(44%)。年龄在25到76之间,平均年龄47岁。手术切除的新鲜组织标本立即于液氮中速冻后,置于-70℃超低温冰箱中保存。所有关于人体的实验均符合赫尔辛基宣言,并取得了患者的知情同意。(二)主要试剂羊抗人DTR/proHB-EGF多克隆抗体,小鼠抗β-actin单克隆抗体和增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒均购于美国SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY公司;辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG,辣根酶标记的兔抗山羊IgG和二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司;免疫组化链霉亲和素—过氧化物酶(SP)试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供。(三)主要仪器匀浆机;电子分析天平;恒温震荡水浴箱;台式低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;-70℃超低温冰箱;恒温冰冻切片机;液氮罐。二、实验方法(一)H＆E(hematoxylin and eosin,H＆E)染色根据H＆E染色结果按照WHO中枢神经系统肿瘤的分类标准(2000)对人脑胶质瘤进行病理诊断和分级,每个病理级别为一组。(二)Western Blot法测定DTR在各病理级别中的表达水平,分析人脑胶质痛中DTR表达水平与其病理级别间的相关性。(三)免疫组化SP法测定不同病理级别中DTR表达与分布,分析人脑胶质瘤中DTR的表达水平与其病理级别间的相关性。(四)图像分析Western Blot结果用Chemi Imager 5500 V2.03软件扫描,用捷达图像分析系统v3.3软件定量分析显色带的整合光密度值(Integrated Density Value,IDV)。免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并目标平均光密度值(Average Optical Density,AOD)进行半定量分析。(五)统计学处理计量资料结果用(?)±s表示,实验数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,组间多重比较采用单因素方差分析的最小有意义差(the least significantdifference,LSD)法。采用相关分析和一元线性回归对人脑胶质瘤DTR表达水平与其病理级别进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果一、H＆E染色进行人脑胶质瘤的病理诊断与分级根据WHO中枢神经系统肿瘤的分类标准(2000),32例人脑胶质瘤中,Ⅰ级10例,Ⅱ级12例,Ⅲ级10例,Ⅳ级0例。每个病理级别为一组,共三组。3例脑挫裂伤手术获得的正常脑组织标本作为对照组。二、Western Blot法测定DTR的表达水平测定的DTR的表达水平取其IDV值与对应β-actin的IDV值的比值。DTR在肿瘤细胞中表达,而在对照组中不表达。在各病理级别的脑胶质瘤中,DTR与对应的β-actin的IDV值之比分别为0.1070±0.0265,0.1592±0.0322和0.2730±0.0425;两两组间比较,P=0.000,差异均有统计学意义,且Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ级;DTR的表达水平与其病理级别的相关分析,r=0.877,P=0.000,呈显著正相关;进行回归分析,直线回归方程为Y=0.083X+0.0127。三、免疫组化法测定DTR的分布与表达水平免疫组化SP法检测结果显示,对照组中DTR呈阴性表达,而每一级别人脑胶质瘤细胞均有免疫反应棕色阳性颗粒分布,着色部位在细胞膜和细胞质,细胞核无着色。在各病理级别人脑胶质瘤中,DTR的OD值分别为0.1923±0.0203,0.2084±0.0211,0.2455±0.0384,Ⅰ、Ⅱ级组间比较,P=0.008,Ⅰ、Ⅲ级和Ⅱ、Ⅲ级组间比较,P=0.000,差异均有统计学意义,且Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ级;脑胶质瘤中DTR表达水平与其病理级别做相关分析,r=0.609,P=0.000,呈显著正相关;进行回归分析,直线回归方程为Y=0.026X+0.164。讨论我们利用人脑胶质瘤组织首次证明了在不同病理级别的脑胶质瘤中,DTR的表达水平存在差异,且Ⅰ级<Ⅱ级<Ⅲ级,并与其病理级别呈显著正相关关系。DTR,也称作proHB-EGF,是属于表皮生长因子超家族的肝素结合表皮生长因子(heparinbinding-epidermal growth factor,HB-EGF)的膜结合前体,它可以经由蛋白水解分裂为有76-87氨基酸残基的可溶性肝素结合表皮生长因子(solubleHB-EGF,sHB-EGF)。免疫组化结果显示,在人脑胶质瘤细胞中,HB-EGF主要是以DTR形式表达的。体外的人脑胶质瘤细胞中,DTR的表达是由bEGF、EGF或TGF-α诱发的,而体内的人脑胶质瘤细胞产生TGF-A和bEGF,这些现象提高了肿瘤衍生的多种生长因子相互调控他们的信号转导路径的可能性,以及在刺激神经胶质瘤细胞生长中发挥了很重要的作用。同时,这些生长因子交叉反应也可能引起胶质瘤中DTR的过量表达。随着人脑胶质瘤细胞成几何级数生长和病理级别的升高,这一作用可能被放大,从而使DTR的表达随着病理级别的升高而增加。DTR在人血管内皮细胞上表达,可以介导与抗该受体的单克隆抗体连接的外源性药物,经胞吞胞吐作用转运到脑组织中。同时我们的研究发现,DTR在人脑胶质瘤细胞中高表达,提示该药物可以进一步特异地作用于脑胶质瘤细胞。以白喉毒素的无毒突变体CRM197为载体,经DTR介导的药物转运不用破坏BBB的屏障特性,就可以通过内皮细胞进入脑,提示DTR介导的药物转运途径可能成为一种新的中枢神经系统药物转运方式用来靶向的治疗人脑胶质瘤。我们的研究发现,脑胶质瘤中DTR的表达水平与其病理级别呈显著正相关,且线性回归方程有统计学意义。据此可以推测,病理级别高的脑胶质瘤患者,因为其DTR的表达水平较高,所以由DT及其类似物CRM197介导的药物转运的效应可能更加显著,从而可能取得良好的疗效。结论1、不同病理级别的人脑胶质瘤组织中,DTR的表达水平存在差异,且Ⅰ级<Ⅱ级<Ⅲ级.2、人脑胶质瘤组织中,DTR的表达水平与其病理级别呈显著正相关关系。