背景与目的面肩肱型肌营养不良症（Facioscapulohumeral muscular dystrophy,FSHD）是最常见的肌营养不良症之一,常染色体显性遗传,约30%为新生突变。本病在临床上具有显著的家系间和家系内异质性,表现为从无症状携带者到致残状态（需坐轮椅）不同程度。近期荷兰统计其发病率约为1:8333。临床表现为进行性、不对称性（或对称性）的肌无力和肌萎缩,一般先累及面部和肩胛带肌,逐渐进展累及上臂、腹部、骨盆带和下肢肌群。虽然此病情进展相对缓慢,但致残率高,约20%患者需坐轮椅,严重影响生存质量,而目前尚无有效的治疗药物。FSHD1型的致病原因主要与4号染色体长臂亚端粒区（4q35）内的一条Eco R1片段内3.3 kb的D4Z4大卫星串联重复序列（DRs）的多拷贝缺失相关,患者缩短至1-10个（<38 kb）并携带下游4q A/4q A-L等位序列,而正常人为11-100个拷贝（>38 kb）。导致DUX4基因表达的4q A等位基因共同作用而使其甲基化程度降低,进而通过表观遗传学机制而发挥作用,最终导致DUX4在骨骼肌中去抑制重新表达而致病。因FSHD是一种独特而复杂的遗传疾病,目前尚未有有效的针对性治疗措施。动物模型作为一种载体可用于致病机制及治疗的研究。基于对上述的表观遗传学致病机制的理解,研究人员得以设计模型,从而能进一步对FSHD机制有更深的理解,及探索FSHD相关的通路及其治疗。由于DUX4蛋白有很高的胚胎致死率,一般的AAV-DUX4、D4Z4-2.5、i DUX-2.7小鼠模型由于其寿命的短暂或缺乏可评估的肌肉表型,不适合作为肌营养不良疾病的长期研究,而FLEx DUX4小鼠模型,通过使用FLEx定向开关系统设计的,绕过胚胎DUX4转基因表达的胚胎致死性。通过与带有肌肉组织特异性启动子ACTA1-cre的工具鼠交配以后,启动cre,表达低剂量Dux4-fl。后用低、中、高剂量的它莫昔芬（TMX）来诱导DUX4不同的表达量可以模拟疾病的不同时期从而加深对该疾病的认识,及发现潜在治疗靶点。尽管FSHD病情进展相对缓慢,一般不影响寿命,但是致残率高,20%的病人在后期需要依赖轮椅出行,这给社会及家庭带来了沉重的负担,严重地影响了个人的生活质量。因此本研究的第一部分旨在通过对轮椅依赖型面肩肱型肌营养不良症患者的基因型-表型关系的研究,探讨轮椅依赖型面肩肱型肌营养不良症患者影响病情严重程度的因素,并为更多严重的FSHD患者提供咨询和疾病未来进展的预判。然而单纯DUX4蛋白表达异常难以解释FSHD的发病机制,DUX4基因可能通过影响潜在的通路参与疾病的发生与发展。近年来,由于流式细胞技术的发展,通过流式细胞技术,可以从骨骼肌细胞中分选出纤维/脂肪原性祖细胞（FAPs）是介导前肌原性信号的肌间质祖细胞肌肉稳态和再生。它最具有代表性的标记物PDGFRα,它的表达与肌肉组织的纤维化成正相关。在肌肉疾病中,WNT/GSK/β-catenin信号是通过激发胰岛信号来调控FAP脂肪生成的重要的通路,通过自分泌/旁分泌控制FAP脂肪生成和脂肪浸润。此外,抑制GSK3可以有效地刺激FAP前肌原性作用,通过刺激卵泡素分泌、使肌卫星细胞（MUSC）分化成成熟的肌管。本研究第二部分内容旨在通过对FSHD小鼠模型的初步研究及病人来源的FSHD原代细胞使用WNT信号通路中的分子GSK3β抑制剂LY2090314,观察小鼠肌肉组织中相关的表型及病理变化。通过抑制WNT/GSK/β-catenin信号通路中的GSK3的研究可以帮助我们拓展肌病治疗的新思路。研究对象与方法1.纳入84例轮椅依赖型面肩肱型肌营养不良症患者,进行前瞻性、单中心、病例对照观察性研究。用Mann-Whitney U检验（非参数检验）比较计量资料,用卡方检验（Chi-square test）或Fisher确切检验（Fisher’s exacttest）比较分类资料,用Spearman秩相关检验（Spearman’s rank correlationtest）评估表型-基因型相关关系,p<0.05有统计学意义。统计软件为SPSS26.0。2.从美国Jackson实验室（The Jackson Laboratory）引进FLEx DUX4小鼠模型（Stock No.028710）,通过腹腔注射（IP）它莫昔芬（注射剂量大约为100ul/20g）连续5天每天注射一次诱导DUX4基因表达。将14周龄TMX诱导表达后的双转基因小鼠作为实验对象（n=3）,实验组连续注射LY2090314（GSK3β抑制剂）3天,（注射剂量25mg/kg）,对照组连续注射3天同等剂量的DMSO。通过四肢攀爬试验,检测小鼠肌力的变化,通过称量体重来评估肌肉含量的改变。组织切片HE染色及天狼星染色镜下观察肌肉组织的病理改变,q PCR检测DUX4基因的表达量,Western blot检测DUX4蛋白的表达情况。3.本研究符合医院伦理委员会规定,均取得知情同意。结果1.84例轮椅依赖型FSHD患者中,34例男性（40%）,50例女性（59%）,其中2例（2%）女性患者妊娠分娩后症状加重后开始使用轮椅。就诊年龄中位数为40岁（16-81岁）;起病年龄中位数为13岁（5-81岁）;失去独立行走能力的起始年龄中位数为33岁（13-82岁）;下肢受累的起始年龄中位数20岁（5-55岁）,开始使用轮椅年龄中位数为34岁（16-82岁）;41例患者（39%）起病于上肢;12例患者（11%）起病于下肢;34例（40%）表现出翼状肩;26例（31%）早发型FSHD患者;44例（52%）经典型FSHD患者;12例（14%）晚发型FSHD患者;临床评分中位数为10分（6-15分）;临床严重程度评分（CSS）中位数为4分（1-5分）;年龄校正的临床严重程度评分（ACSS）中位数为183分（50-370分）;MRC评分中位数为93分（58.5-133分）;DRs中位数为3个（2-8个）;D4Z4甲基化水平的中位数为39%（16%-63%）;14例患者（16.6%）为当代突变;呼吸功能异常的有11人（13人参与测试）,其中5例（38.4%）重度限制性通气功能障碍,3例（23.1%）中度限制性通气功能障碍;3例（23.1%）轻度限制性通气功能障碍;33人参与脊柱检查,其中19位患者（57.5%）脊柱畸形;心肌酶中肌酸激酶（CK）比正常稍高;20例参与检测的患者四肢肌电图基本上呈肌源性损害,4例参与肌肉活检的患者肉病理表现为肌营养不良改变,心电图异常以不完全右束支传导阻滞及窦性不齐最常见。35例患者行听力及视力检测,其中视觉异常的7例（20%）,听力异常的5例（14%）;相关性分析提示D4Z4重复单元数量与起始使用轮椅年龄及下肢受累起始年龄呈正相关（P1=0.0006;P2=0.0399）;起病年龄与起始使用轮椅年龄及下肢受累起始年龄呈正相关（P3<0.0001;P4<0.0001）。单因素比较分析发现,47例起始使用轮椅年龄≤35岁FSHD患者相比34例起始使用轮椅年龄>35岁FSHD患者,其起病年龄、下肢受累的起病年龄,D4Z4重复单元数量更小,MRC评分较低,FSHD临床严重程度评分较高,且ACSS也较高,当代突变率较高。2.两组小鼠四肢攀爬实验,比较具有统计学差异（P=0.0078）。病理上,经TMX 75mg/kg/d连续注射7d的双转基因鼠为实验组,HE染色可见大小不一的肌纤维,肌细胞核内移,细胞膜完整性破坏,细胞周围有炎细胞浸润;未用TMX诱导的对照组可见大小不一的肌纤维,肌细胞核内移。在腹腔注射（IP）TMX后16天后检测DUX4-fl m RNA表达水平,对照组DUX4-fm RNA相对表达量与实验组的DUX4-fl m RNA的相对表达量相比具有统计学意义（p=0.0078）;IP连续注射LY2090314（GSK3β抑制剂）3天的实验组与注射DMSO的对照组相比,肌肉病理切片HE染色镜下可见肌纤维萎缩与肥大并存。肌纤维间隔变窄,炎细胞减少;镜下可见14周龄的对照组Dux4-cre+DMSO与实验组Dux4-cre+LY2090314小鼠,腓肠肌天狼星染色,红色纤维的含量,明显高于对照组（n=5,p=0.0079）;q PCR显示DUX4下游靶基因Trim36-m RNA表达量对照组为1,实验组为0.847;成纤维基因Col1a1-m RNA表达量对照组为1,实验组为0.395,（n=3）。Western blot检测GSK3-β的总蛋白与磷酸化的P-GSK-3β（Ser9位点）,以及DUX4蛋白的表达量,结果显示（图12）,GSK-3β/GAPDH差异无统计学意义（p=0.95）,P-GSK-3/GAPDH及DUX4/GAPDH差异有统计学意义（p1=0.0008,p2=0.0002）,（n=3）。通过对FSHD病人肌肉活检,并进行肌细胞原代培养,对正常对照与病人分别进行流式细胞仪分选出肌卫星细胞（MUSC）与纤维原性祖细胞（FAPs）,可见正常对照MUSC（CD56）:FAPs（CD140a）83.1%:2.18%,FSHD患者MUSC（CD56）:FAPs（CD140a）0.37%:94.9%。结论1.84例轮椅依赖型FSHD患者,起病年龄、下肢受累起始年龄早、4q35-D4Z4重复序列缺失范围大,是早期出现轮椅依赖的可能因素;47例起始使用轮椅年龄≤35岁FSHD患者相比34例起始使用轮椅年龄>35岁FSHD患者其起病年龄、下肢受累的起病年龄更早,D4Z4重复单元数量更小,MRC评分较低,FSHD临床严重程度评分较高,且ACSS也较高,当代突变患者相对多见。起病年龄及下肢受累的起始年龄可以作为疾病严重程度的预后评估指标。2.FLEx DUX4系小鼠经过TMX诱导后,可出现FSHD部分临床及病理表型,能进行DUX4致病的病理生理机制研究,及作为在体内进行DUX4靶向干预的合理模型;WNT/GSK/β-catenin信号通路中的分子GSK3β对调控FAPs纤维的生成起到了一定的作用,并且可一定程度上可改善肌肉组织微环境、炎细胞的浸润程度;在FSHD病人肌细胞中的肌卫星细胞池的耗竭及与纤维祖母细胞（FAPs）比例失调可能是使FSHD病人肌细胞再生速度不及肌细胞变性坏死的速度而导致失代偿的原因之一。