论文部分内容阅读
研究背景:胃癌(Gastric Cancer)作为世界上第四大常见癌症,其致死率高居癌症患者致死原因的第二位,严重威胁人类健康。因其早期发病较隐匿,一般有症状患者大多已发展至晚期,故胃癌患者的早期诊断和治疗对其预后至关重要。现阶段胃癌的诊断主要依靠患者的临床表现、内镜及组织病理学检查、影像学检查等综合方法。由于缺乏合适的分子生物标志物,大多数胃癌患者确诊时已是晚期,错过了最好的手术治疗时机,因此,合适的分子生物标志物的发现必然有助于胃癌的早期诊疗及新的治疗策略的发展。日益受到关注的长非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)与肿瘤的发生有密切的关系,所以在肿瘤细胞中表达异常的LncRNAs有望成为肿瘤标志物用于肿瘤诊断。又因LncRNAs可通过多种途径调控肿瘤相关蛋白的表达,对其作用机制的深入研究可能为肿瘤治疗提供新的靶点。LncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码RNA,许多研究已经证实LncRNA在不同类型的肿瘤中异常表达,并且在肿瘤发生和发展中起着促癌或抑癌的作用。目前,肿瘤相关的LncRNA已经在组织、血液、尿液、唾液等样品中检测发现。因此,LncRNA有望成为肿瘤诊断和预后的新型肿瘤标志物。吉林大学计算机学院何叶等人采用生物信息学方法深入挖掘转录组数据,通过对胃癌的GSE30727、GSE13195和GSE33335三个数据集进行分析,发现LncRNA LINC00365和抑癌基因乳腺珠蛋白2(Secretoglobin family 2A member1,SCGB2A1)在胃癌中共同低表达,并具有相关性。同时,发现在胃癌中共同差异表达的LINC00365具有很大的显著性。LINC00365的染色体位置是13q12.3,通过对与LINC00365既共表达的编码基因进行分析,找到可分泌入血液,也可分泌入尿液的蛋白SCGB2A1,因此,可将LncRNA与这些编码基因作为胃癌的组合生物标志物。研究目的:本研究基于临床胃癌患者组织样本和人胃癌细胞系,检测LINC00365和SCGB2A1表达差异,通过分子克隆方法在胃癌细胞系中过表达LINC00365,观察其对SCGB2A1表达及细胞增殖的影响,进一步阐明LINC00365通过调控SCGB2A1在胃癌中作用的机制。研究方法:已确诊为胃癌的90例患者组织芯片,原位杂交技术(In Situ Hybridization,ISH)检测LINC00365的表达,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)法检测SCGB2A1蛋白表达;通过RT-qPCR法检测LINC00365和SCGB2A1在30例胃癌患者癌与癌旁组织及胃正常粘膜细胞系GES-1、胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803和BGC-823中的差别表达。在人胃癌BGC-823和MGC-803细胞中转染pc DNA3.1-LINC00365,采用RT-qPCR、蛋白质印记法(Western Blot,WB)检测过表达LINC00365对SCGB2A1的转录、翻译水平的影响;利用MTT法、EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)细胞增殖检测和克隆形成实验,检测过表达LINC00365对BGC-823、MGC-803细胞增殖的影响;Western Blot法检测p-IκBα、IκBα蛋白的表达,免疫荧光法观察NF-κB(p65亚单位)细胞内表达变化;通过双荧光素酶报告基因法检测NFκB转录活性变化,观察过表达LINC00365对BGC-823和MGC-803细胞中NFκB信号通路活性的影响;利用激光共聚焦显微镜和Hoechst 33258染色法观察细胞核变化,流式细胞术检测凋亡细胞数,观察过表达LINC00365对BGC-823和MGC-803细胞凋亡的影响。结果:(1)基于组织芯片的ISH和ICH结果显示,与癌旁组织相比,LINC00365在胃癌组织中表达显著下调,且与SCGB2A1蛋白表达呈正相关。(2)基于确诊的30例胃细胞性胃癌患者的胃癌组织及其癌旁组织结果显示,与癌旁组织相比,癌组织中LINC00365和SCGB2A1在转录水平低表达;人胃癌细胞系SGC-7901细胞、BGC-823细胞和MGC-803细胞中LINC00365和SCGB2A1表达水平均低于正常的胃粘膜细胞系GES-1细胞。(3)以转染pc DNA3.1载体为对照,转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体至BGC-823细胞和MGC-803细胞中,结果显示,过表达LINC00365后,SCGB2A1转录和蛋白水平均上调,细胞增殖率下降,p-IκBα蛋白表达下降,NFκB(p65亚单位)细胞核内蛋白表达降低。(4)Hoechst 33258染色,细胞核无明显染色质凝聚,凋亡细胞数无明显变化,表明过表达LINC00365对BGC-823细胞和MGC-803细胞凋亡无明显影响。结论:(1)在临床胃癌患者组织标本中LINC00365表达水平与SCGB2A1水平呈明显正相关。(2)LINC00365通过影响SCGB2A1表达,调控NFκB信号途径的活化,进而在胃癌细胞增殖中发挥重要作用。