背景阿尔茨海默病属于神经退行性疾病,其病理特征为脑内可溶性β-淀粉样蛋白的过度沉积形成的老年斑（senile plaques,SP）和TAU蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结（neuofibillary tangles,NFTs）^[1]。而脑中β-样前体蛋白APP产生Aβ1-42和Aβ1-40片段,但Aβ1-42片段最长,毒性最强,最易聚集,所以在神经变性过程中作用最强。中药熟地黄为充髓养髓良药,五味子益气生津、镇静安神、补肾宁心。中医古籍认为智力活动的物质基础是脑髓,而脑髓的协调须肾精滋养。五味子和熟地黄单独用药具有抗衰老、益智、改善认知功能及保护神经细胞的作用,但五味子-熟地黄联合用药治疗AD的研究还未报道。目的与单味药物五味子、熟地黄相比,观察五味子与熟地黄联合用药对于AD模型大鼠的学习能力和记忆障碍是否具有更好的改善作用,并探讨其作用机制。方法1阿尔茨海默病模型复制及模型成功判定标准将体重220±20 g的SD雄性大鼠固定在脑立体定位仪上,沿头皮矢状线中段切1.5cm左右切口,在前囟向后约3 mm左右两侧2.1 mm处确定两个坐标点,分别在两个坐标点处用牙科钻打一小孔,再使用微量注射器垂直进针3 mm即为海马CA1区,向大脑海马CA1区注射Aβ1-42溶液5ul,假手术组注射0.9%生理盐水5ul,自第二天起,在颈背部皮下注射25%D-半乳糖溶液150 mg/kg,假手术组皮下注射等量生理盐水,每天1次,连续注射35天。注射Aβ1-42后第28天进行新物体识别试验和Morris水迷宫试验。模型成功的判定标准为:与假手术组大鼠平均值相比,以每只造模大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏期显著延长,并且在平台所在象限停留时间显著减少,穿越平台次数显著减少（均P<0.01）,且外观表现出精神萎靡、步态不稳、反应迟钝、活动量少、饮食饮水量少等“痴呆”症状,表明AD模型制备成功。2造模成功动物分组、组间均衡性检验及给药记录造模成功大鼠在旷场实验中的水平运动次数,按照水平运动次数的多少,从高到低排序编号,并将编号与随机数表对应,以随机区组设计的方法分成7组,即模型组、石杉碱甲组（0.3 mg/kg）、五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物3.2 g/kg组、1.6 g/kg组、0.8 g/kg组,每组10只。经统计上述各组大鼠的水平运动次数的平均值,结果显示无显著性差异（均P<0.05）,然后给药进行后续试验。在手术后第三天开始灌胃给药,每天1次,连续28天。3五味子-熟地黄颗粒对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的改善作用研究方法灌胃结束后,使用Morris水迷宫和新物体识别行为学实验评价大鼠学习记忆能力。（1）Morris水迷宫空间记忆能力测定:第1⁵天为定位航行试验,记录大鼠逃避潜伏期。第6天为空间探索试验,撤去平台,记录与分析大鼠在平台所在象限游泳的时间和距离。（2）新物体识别非空间记忆能力测定:采用新旧物体替换法测试大鼠接触物体所占时间,共3天,大鼠对新、旧物体的探究时间分别记为Tn和Tf。大鼠接触新旧物体的识别记忆能力用辨别指数DI=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）×100%来评价。4五味子-熟地黄颗粒对阿尔茨海默病大鼠大脑病理学的改善作用研究方法Morris水迷宫试验结束后各组大鼠麻醉取全脑,浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定,利用HE染色观察组织细胞的变化,尼氏染色观察海马神经元和尼氏体的变化。5五味子-熟地黄颗粒改善阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的机制研究方法Morris水迷宫试验结束后取脑并分离海马区,提取海马总蛋白,采用免疫印迹法检测学习记忆相关通路BDNF-TrkB-CREB蛋白和突触功能蛋白PSD95和SYP的表达,使用ELISA试剂盒检测海马中乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的含量。6五味子-熟地黄颗粒对AD模型大鼠Aβ和TAU合成机制的改善作用研究法Morris水迷宫试验结束后腹主动脉取血分离出血清,分离大脑皮层和海马组织,分别测定血清和海马组织中Aβ1-42和Aβ1-40的含量。采用免疫印迹法检测海马组织中阿尔茨海默病相关蛋白AKT、GSK3β、Aβ1-42、APP、TAU的表达,同时使用免疫组化的方法观察海马区Aβ1-42蛋白表达。结果1五味子-熟地黄颗粒改善AD模型大鼠体质与体重的效果优于单药与假手术组相比,模型组各组大鼠均有不同程度的反应迟缓,饮食量减少,饮水量减少,大小便减少,毛发发黄,光泽不足,明显嗜睡。与模型组相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组上述症状均有改善。与假手术组相比,模型组大鼠给药后第三、四、五周体重具有显著降低（P<0.01）;与模型组相比,联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2g/kg组大鼠体重显著增加（均P<0.05）;与五味子1.6 g/kg组或者熟地黄1.6 g/kg组相比,联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组大鼠体重显著增加（均P<0.05）。2五味子-熟地黄颗粒改善AD模型大鼠学习记忆能力的效果优于单药（1）定位航行试验与假手术组相比,模型组大鼠第二天,第三,第四,第五天逃避潜伏期均显著延长（均P<0.01）,表明Aβ1-42可以显著降低大鼠的空间记忆获取能力。与模型组相比,上述每天联合药物1.6 g/kg组、3.2 g/kg组逃避潜伏期显著缩短（P<0.01）。与五味子1.6 g/kg组或者熟地黄1.6 g/kg组相比,上述每天联合药物1.6 g/kg组、3.2 g/kg组逃避潜伏期显著缩短（均P<0.01）。（2）空间探索试验各组大鼠游泳平均速度之间没有显著差异（均P>0.05）。与假手术组相比,模型组大鼠穿越平台时间和次数均显著减少,在平台区域停留时间和目标象限距离显著减少,在平台区域停留时间和目标象限穿越频次也显著减少（均P<0.01）;表明Aβ1-42可以显著降低大鼠的空间记忆保持能力。与模型组相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组上述各项指标均显著增加（P<0.05）;与五味子1.6 g/kg组或者熟地黄1.6 g/kg组相比,联合药物1.6 g/kg组上述各项指标均显著增加（均P<0.05）。3五味子-熟地黄颗粒改善AD模型大鼠大脑病理结构的的效果优于单药模型组大鼠脑切片海马区神经元排列较散乱,尼氏体大小、形态也不规则,数目较少,分布不均,整体不够清晰,轮廓模糊,甚至有大量尼氏体溶解消失。椎体细胞排列紊乱,部分细胞出现空泡变性,大量细胞出现固缩坏死。与模型组相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组大鼠脑组织海马CA1区和CA3区组织细胞总体染色较浅,细胞界限清晰,排列较整齐,细胞内结构及核仁淡染;神经元排列稀疏紊乱,尼氏体染色较深,数量较多,轮廓清晰,形状比较圆润。而联合药物1.6 g/kg组、3.2 g/kg组脑切片趋于假手术组,损伤程度轻于五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组。4五味子-熟地黄颗粒改善AD模型大鼠学习记忆力的机制与记忆蛋白有关与假手术组相比,模型组大鼠脑海马中的BDNF、TrkB、CREB、SYP和PSD95蛋白表达均显著降低（P<0.01）;与模型组大鼠相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组大鼠海马中BDNF、TrkB、CREB、SYP和PSD95蛋白的表达均显著升高（均P<0.05）。与熟地黄1.6 g/kg组相比,联合药物三个剂量组SYP、BDNF蛋白表达均显著升高,联合药物1.6 g/kg组PSD95蛋白的表达显著升高,联合药物0.8 g/kg组和1.6 g/kg组CREB蛋白表达也升高,而联合药物3.2 g/kg组TrkB蛋白表达显著降低（均P<0.05）。与五味子1.6 g/kg组相比,联合药物三个剂量组的BDNF蛋白表达显著升高,联合药物3.2 g/kg组TrkB蛋白表达显著降低（P<0.05）。与假手术组相比,模型组大鼠海马中的ChAT含量显著降低,AChE含量显著升高（均P<0.01）。与模型组相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组大鼠海马中ChAT均含量显著升高,AChE含量均显著降低（均P<0.05）;与五味子1.6 g/kg组或熟地黄1.6 g/kg组相比,联合药物1.6 g/kg组大鼠海马中ChAT的含量均显著升高,AChE含量均显著降低（均P<0.01）。5五味子-熟地黄颗粒对AD模型大鼠Aβ和TAU蛋白合成机制的影响与假手术组大鼠相比,模型组大鼠海马和血清中的Aβ1-42、Aβ1-40的含量显著升高（P<0.01）;与模型组大鼠相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组大鼠海马和血清中Aβ1-42、Aβ1-40的含量均显著降低（P<0.05）;与五味子1.6 g/kg组或熟地黄1.6 g/kg组大鼠相比,联合药物各组海马中Aβ1-42的含量显著降低（P<0.05）,联合药物1.6 g/kg组也显著降低血清中Aβ1-42、Aβ1-40的含量和海马中Aβ1-40的含量（P<0.05）。与假手术组相比,模型组海马中AKT蛋白表达显著减少,而GSK3β、TAU、APP和Aβ1-42蛋白表达增加（P<0.01）;与模型组大鼠相比,五味子1.6 g/kg组、熟地黄1.6 g/kg组、联合药物0.8 g/kg组、1.6 g/kg组、3.2 g/kg组大鼠海马中AKT蛋白表达显著增加（P<0.05）,GSK3β、TAU、APP和Aβ1-42蛋白表达减少（P<0.05）;与熟地黄1.6 g/kg组或者五味子1.6 g/kg组相比,联合药物0.8 g/kg、1.6g/kg组显著增多AKT表达（P<0.05）,联合药物1.6 g/kg组可以显著降低GSK3β、APP和Aβ1-42蛋白表达（P<0.05）,联合药物各组均显著降低TAU蛋白表达（P<0.05）,免疫组化结果类似。结论1体质学效果观察结论:联合药物0.8 g/kg³.2 g/kg可显著改善AD模型大鼠神疲乏力,反应迟缓,行动萎钝,体力较差,毛色粗糙,饮食量少,排便少或便质稀溏等状况,并可显著增加大鼠体重。2记忆力效果观察结论:联合药物1.6 g/kg³.2 g/kg组可显著提高相对辨别指数,显著改善了AD模型大鼠的识别记忆能力,缩短逃避潜伏期,增加穿越平台的次数和时间,延长目标象限停留时间和目标象限停留距离,增加平台区域停留时间和目标象限穿越频次,显著改善了AD模型大鼠的空间记忆能力。3形态学效果观察结论:联合药物0.8 g/kg³.2 g/kg能显著促进AD模型大鼠脑组织尼氏小体的修复,减轻神经元细胞的损伤。4与同等剂量的单味五味子或单味熟地黄相比,联合药物在改善AD大鼠体质,增加大鼠体重,增强定位航行试验与空间探索试验中的大鼠学习记忆能力,以及改善脑组织损伤等方面,其效果均优于单药。5作用机制观察结论:联合药物0.8 g/kg³.2 g/kg可以显著升高AD模型大鼠与学习记忆相关的脑内SYP和PSD95、BDNF、TrkB和CREB蛋白表达和胆碱乙酰转移酶的含量,显著降低乙酰胆碱酯酶的含量;并能显著降低与AD病理性Aβ和TAU蛋白合成相关的海马和血清中Aβ1-40和Aβ1-42的含量,增加AKT蛋白表达,降低GSK3β、TAU、APP和Aβ1-42蛋白表达。这可能是五味子-熟地黄联合治疗阿尔茨默病的作用机制。