研究目的婴幼儿期是脑组织发育的关键时期,采取有效措施促进脑组织发育,修复脑组织缺损才能从根本上治愈脑瘫。本实验利用补肾益髓中药左归丸和鼠神经生长因子干预骨髓间充质干细胞体外分化,提高神经干细胞转化率,探索脑瘫早期治疗的新途径和补肾益髓中药作用机制。研究方法实验一：大鼠MSCs提取和体外培养扩增的研究。本研究采用密度梯度离心法分离培养鼠MSCs。实验二：左归丸和mNGF对鼠MSCs体外诱导分化的影响。诱导分化阶段按照干预因素不同分组如下：对照组,MSCs组,mNGF组和MSCs+mNGF组。各干预组均按照不同剂量设置多个样本,分化完成后进行转化率统计和免疫组化检测NSCs标志蛋白,确认NSCs属性。实验三：大鼠脑瘫偏瘫模型制作和行为学评估。采取直流电毁坏单侧锥体束方法,共55只SD大鼠,分4组。每组12只,7只备用。实验四：选择实验二各组最优转化结果获得的NSCs植入偏瘫模型大鼠脑部损害区进行疗效观察研究。分组同实验二。分批于0,1,2,4,6进行BBB运动行为评估和处死取脑组织行HE染色,观察脑损害区修复和神经元分裂增殖情况。研究结果实验一：MSCs易于体外扩增,传代细胞4-5d可增殖1倍,培养细胞可稳定生长传代,具有较强的自我更新和多系分化能力。流式细胞仪分析细胞表面抗原,结果表明本实验中分离扩增的MSCs具有均一的细胞表型,表明细胞纯度较高、生物学特性稳定；MSCs作为组织工程的种子细胞具有极大的潜力。实验二：诱导分化阶段按照干预因素不同分组如下对照组(单纯MSCs培养),左归丸组,mNGF组和左归丸+mNGF组。不使用DMSO,β-巯基乙醇等化学合成抗氧化剂。分化完成后检测NSCs标志蛋白,确认NSCs属性。体外分组干预试验显示左归丸有促进MSCs转化为NSCs作用,但不及mNGF影响明显,二者同时应用则强于单纯使用mNGF干预,说明有协同作用,且分化的神经细胞中胶质细胞少。实验三：大鼠痉挛性脑瘫模型的制作。大鼠痉挛型脑瘫偏瘫模型制备采取直流电毁坏SD大鼠单侧锥体束方法,能够使大鼠出现脑瘫偏瘫型运动障碍,模型可靠稳定。本实验结束时7只死亡,共获得48只偏瘫模型大鼠。实验四：NSCs植入痉挛型脑瘫大鼠模型在体观察。分组同实验二。对照组手术时只进行露骨钻孔,微量注射器插入,不加MSCs或任何干预药物。各实验组用微量注射器缓慢注入实验二诱导后获得的NSCs。动物实验证实,NSCs移植治疗脑瘫和脑损伤可明显改善肢体功能。脑组织切片观察到神经元分裂增殖和修复现象。BBB运动行为评估表明移植后3周实验组后肢运动评分逐步提高,对照组无明显改变。对照组与其余三组在NSCs植入后7d无显著差异(p>0.05)。其后各时间点对照组与其余三组间有显著差异(p<0.01)。左归丸组、mNGF组之间比较无显著差别(p>0.05),左归丸+mNGF组与左归丸组、mNGF组之间有显著差异(p<0.01)。实验表明左归丸能够促进MSCs转化为NSCs,结合其它多项补益类中药类似结果,说明补肾益髓中药与干细胞有着密切联系,“肾精与髓”很有可能就是具有多项分化潜能的干细胞。通过补肾益髓激活干细胞,进而分化为具有特定机能的细胞群,修复凋亡的细胞组织,满足机体需要,改善机体功能。我们期待经过进一步深入研究,特别是能够应用灵长类动物模型进行实验,成功后将干细胞治疗技术应用于脑瘫临床,造福广大患者。本课题在深入文献研究的基础上,针对脑瘫治疗中的难题,选择中药干预MSCs体外定向诱导分化及移植治疗鼠痉挛型脑瘫作为突破口,发挥中医药补肾益髓理论优势,积极探讨脑瘫早期治疗的新途径,探索补肾益髓理论的作用机制和细胞学基础。结论●大鼠MSCs易于获得,体外扩增快。在不使用抗氧化剂的情况下左归丸对MSCs体外诱导分化有明显促进作用；●本研究首次应用mNGF干预MSCs分化,证实mNGF能够促进MSCs的分化和NSCs成熟,左归丸+mNGF同时干预MSCs分化效果最好；●在体移植实验表明MSCs诱导获得的NSCs能够部分修复脑组织缺损,移植3周后大鼠脑瘫模型运动功能逐步改善。