论文部分内容阅读
目的:探讨在角膜中期保存过程中角膜内皮细胞发生自噬的作用及内在机制。方法:用Optisol保存大鼠角膜,建立角膜中期保存的模型。茜素红染色观察角膜内皮细胞数目、形态,免疫荧光染色检测内皮细胞结构及功能相关标志物ZO-1、F-actin、N-cadherin及Na+-K+-ATPase的表达变化,扫描电镜观察内皮细胞超微结构的改变;蛋白质印迹和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1、SQSTM1/P62表达的改变;TUNEL染色和免疫荧光染色检测活化的caspase3观察细胞凋亡的情况;我们还进行了大鼠的角膜移植,并研究了自噬激动剂或抑制剂(雷帕霉素或氯喹)的作用。结果:在角膜保存过程中,随时间延长,角膜内皮细胞数量逐渐减少,出现形态改变,细胞核皱缩,细胞连接ZO-1不完整、细胞骨架F-actin、细胞表面黏附分子N-cadherin破坏,Na+-K+-ATPase异常表达。扫描电镜显示角膜内皮细胞间连接断裂,细胞水肿,表面微绒毛消失。同时,免疫荧光和免疫印迹等检测方法显示LC3Ⅱ及Beclin1的表达随时间延长先增后减,15d达峰值;SQSTM1/P62变化趋势与之相反。并发现TUNEL阳性细胞数和AC-caspase-3的表达随时间延长逐渐增多。此外,在保存液中加入自噬抑制剂氯喹,能明显增加TUNEL阳性细胞比例和AC-caspase-3的表达,内皮细胞死亡率升高,破坏程度加重,大鼠角膜移植一周后角膜仍呈现浑浊状态;而加入自噬激动剂雷帕霉素后则反之,凋亡率降低,内皮细胞存活率升高,形态结构功能相关指标均有所改善,大鼠角膜移植后一周角膜呈较为透明的状态。结论:角膜保存过程中内皮细胞活性逐渐下降,会诱导其发生自噬。我们发现在一定程度上促进自噬能减少凋亡,促进内皮细胞存活,改善内皮质量,延长保存时间,表明内皮细胞的自噬在保存过程中发挥保护性作用。