乌桕离体再生与农杆菌介导的转基因技术研究

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乌桕(Sapium sebiferum Roxb.)是我国重要的木本油料树种,其种子富含油份。由于乌桕对气候、海拔及土壤要求不高,且乌桕梓油制备的生物柴油质量好,因此,乌桕是非常具有潜力的生物质能源资源之一。为了利用转基因技术对乌桕进行遗传改良,我们研究了细胞分裂素和生长素对乌桕离体再生的影响,并在此基础上研究了通过根癌农杆菌介导方法将拟南芥ATFATB1基因转入乌桕细胞中的转基因技术,主要获得了以下结果:   1.成熟的乌桕种子在75%的乙醇消毒3 min后、再在20%NaClO溶液中消毒40 min,除菌效果最好,在MS培养基上无菌萌发率为86%。   2.含2.0 mg/L BA、0.5 mg/L NAA和1.0 g/L活性炭的MS培养基为诱导乌桕下胚轴形成不定芽的最佳培养基,不定芽诱导率为82.4%;含1.0 mg/L BA和0.2 mg/L NAA的培养基为子叶和真叶不定芽诱导的最佳培养基,其诱导率分别为65.7%和50%。   3.将不定芽伸长的幼茎切成带侧芽或者顶芽的小段、接种在含0.2 mg/L BA的MS培养基上,94%的茎段可以形成新的幼茎。   4.乌桕不定芽或者幼茎在含0.5 mg/L IBA和1.0 g/L活性炭的MS培养基生根效果最好,达到100%,生根的植株经炼苗、移栽后,生长正常。   5.卡那霉素敏感试验证明,乌桕下胚轴外植体对卡那霉素的敏感临界浓度为30 mg/L。   6.利用RT-PCR克隆了拟南芥脂肪酸合成途径中重要基因ATFATB1,并构建了CaMV35S启动子驱动的组成型表达载体,并将其导入根癌农杆菌EHA105菌株中。   7.将乌桕下胚轴切成0.5 cm长的小段,然后对切,在根癌农杆菌菌液中浸泡30min,然后转至含2.0mg/LBA、0.5 mg/LNAA和200μM AS的共培养基上培养三天,再转移到含2.0 mg/L BA、0.5 mg/LNAA、1.0 g/L活性炭、30 mg/L:Kan和100 mg/L Timentin的选择再生培养基上诱导不定芽,最后将抗性不定芽转到含0.5 mg/L IBA和50 mg/L Timentin的生根培养基上进行生根。用GUS染色方法筛选出了转基因乌桕植株。
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