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原发性肝癌主要由肝细胞癌(HCC)组成，是世界上人类最常见的恶性肿瘤之一，预后极差，5年生存率不到9%，每年HCC相关死亡的数量超过600000。核因子-κB（Nuclear factor-κappa B，NF-κB）是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，存在于多种组织的多种细胞中，具有广泛的生物学活性，激活后参与许多基因的转录调控，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程。近年的研究表明NF-κB与肝癌的发生、发展、耐药、浸润与转移关系非常密切。去甲斑蝥素（norcantharidinNCTD）是从天然斑蝥分离出来的斑蝥素脱甲基而成，它具有抗肿瘤、升高白细胞、抗病毒及调节免疫等作用，比斑蝥素毒副作用更小。目前已用于治疗原发性肝癌，食管癌等肿瘤的治疗。但NCTD在诱导肝癌细胞发生凋亡的过程中NF-κB通路的变化及对JNK影响国内外少有报道。本实验通过观察NCTD作用于肝癌细胞SMMC-7721对细胞形态、增殖与凋亡的影响，并观察在加用NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)前后NF-κB和JNK通路的变化，旨在探讨NF-κB在肝癌细胞凋亡中的作用和意义及对JNK通路影响，从而进一步阐明NCTD治疗肝癌的机理，并为其进一步开发利用提供理论依据。目的：本课题旨在通过不同浓度NCTD作用SMMC-7721来观察其对肝癌细胞增殖与凋亡的影响，并加用PDTC抑制NF-κB通路，探讨NF-κB在NCTD诱导肝癌细胞凋亡中的作用和意义及对JNK通路的影响。方法：1MTT法观察不同浓度NCTD作用SMMC-7721后其对肝癌细胞增殖的影响。2Hoechst33342染色通过对荧光显微镜下形态学变化的观察研究NCTD对SMMC-7721凋亡的影响。3流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI法检测SMMC-7721细胞凋亡率来观察NCTD对SMMC-7721凋亡的影响。4Western blotting检测细胞核NF-κBp65、胞浆IκBα、JNK及pJNK蛋白的表达。结果：1NCTD对SMMC-7721细胞增殖的影响MTT法结果显示，不同浓度NCTD（5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml）分别干预12h、24h、36h、48h后和对照组比较， A492值明显下降，12h（0.599±0.02、0.585±0.01、0.540±0.01、0.505±0.01、0.428±0.01）和对照组（0.635±0.01）；24h（1.068±0.08、1.053±0.09、0.961±0.01、0.878±0.11、0.699±0.12）和对照组（1.218±0.07）；36h（0.582±0.01、0.533±0.01、0.506±0.02、0.400±0.03、0.283±0.02）和对照组（0.720±0.02）；48h（0.699±0.06、0.595±0.02、0.510±0.06、0.435±0.04、0.252±0.03）和对照组（0.885±0.07），均具统计学意义(P<0.05)，说明NCTD对SMMC-7721增殖有抑制作用，具有剂量依赖的特点（Table1）。增殖抑制率结果显示，不同浓度NCTD（5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml）分别干预12h、24h、36h、48h后和对照组比较，12h（5.63±0.10、7.97±0.14、15.22±0.66、20.56±0.89、32.66±1.51）和对照组（0）；24h（11.47±0.72、13.86±0.83、21.78±1.26、27.09±0.94、43.30±0.09）和对照组（0）；36h（19.32±0.94、25.51±1.06、29.58±1.48、44.30±1.35、59.30±1.37）和对照组（0）；48h（21.28±1.15、33.20±1.30、42.40±1.31、50.91±1.32、70.74±0.83）和对照组（0），均具统计学意义(P<0.05)，且不同时间不同浓度NCTD组间比较(P<0.05)亦有统计学意义，说明NCTD对SMMC-7721增殖有抑制作用，具有时间和剂量依赖的特点(Fig.1,Table2）。2通过对荧光显微镜下形态学变化的观察研究NCTD对SMMC-7721凋亡的影响Hoechest33342染色结果显示对照组细胞大小均匀，NCTD干预后，细胞核出现浓缩、凋亡小体出现。40ug/ml NCTD干预SMMC-7721细胞12h、24h、36h、48h后凋亡率（11.21±0.20%、19.83±0.76%、28.00±1.00%、34.13±1.00%）依次升高，与对照组（4.33±0.15%）比较有统计学意义（P<0.05）组间比较亦具统计学意义（P<0.05）。说明NCTD可诱导SMMC-7721凋亡，随作用时间的延长凋亡率升高，具有时间依赖的特点。（见Fig.2，Table3）3通过流式AnnexinⅤ-FITC/PI法检测SMMC-7721细胞凋亡率观察NCTD对SMMC-7721凋亡的影响，并观察NF-κB在NCTD诱导SMMC-7721细胞凋亡中的作用。结果显示NCTD干预SMMC-7721细胞48h后，各干预组（5ug/mlNCTD、20ug/ml NCTD、40ug/ml NCTD、PDTC、PDTC+40ug/ml NCTD）SMMC-7721凋亡率（13.27±0.56%、36.80±0.36%、43.17±0.55%、17.53±0.52%、50.23±1.35%）和对照组（5.70±0.20%）比较有统计学意义（P<0.05）。不同浓度NCTD（5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml）组间比较有统计学意义（P<0.05），说明NCTD诱导SMMC-7721凋亡具有浓度依赖的特点。 PDTC组（17.53±0.52%）凋亡率与对照组（5.70±0.20%）比较有统计学差异（P<0.05），说明抑制NF-κB通路可诱导凋亡，并且PDTC+40ug/mlNCTD组（50.23±1.35%）较40ug/ml NCTD组（43.17±0.55%）细胞凋亡率进一步增加，两者比较具有统计学意义（P<0.05），说明NCTD通过抑制NF-κB通路活性诱导SMMC-7721凋亡。(Fig3，Table4)。4Western blot法检测去甲斑蝥素作用SMMC-7721后及加用PDTC前后NF-κBp65、IκBα、JNK及pJNK蛋白的表达不同组别NCTD（5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、PDTC、PDTC+40ug/mlNCTD）作用于SMMC-7721细胞48小时后，低、中、高浓度组（5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml）核蛋白NF-κBp65（1.85±0.01、1.74±0.01、1.42±0.01）及胞浆IκBα蛋白（1.34±0.01、1.20±0.02、0.85±0.01）的表达依次下降，pJNK蛋白（1.54±0.01、1.72±0.01、1.82±0.01）的表达依次升高，各浓度组间相比有统计学意义（P<0.05）；且与空白对照组NF-κBp65、IκBα及pJNK蛋白的表达（2.02±0.01、1.55±0.01、1.36±0.01）相比有统计学意义（P<0.05）；而JNK低、中、高浓度组（1.98±0.01、1.98±0.01、1.98±0.01）的蛋白表达组间相比无统计学意义（P>0.05），与空白对照组（1.98±0.01）相比无统计学意义（P>0.05），说明NCTD对SMMC-7721核蛋NF-κBp65、胞浆IκBα及pJNK蛋白表达有影响，且有浓度依赖性，随着药物浓度的增高， NF-κB通路抑制和JNK通路激活作用增强。对照组与PDTC组核蛋白NF-κBp65（2.02±0.01、1.63±0.01）及胞浆IκBα蛋白（1.63±0.01、1.55±0.01）的表达明显下降，两者相比有统计学意义（P<0.05），说明PDTC明显阻断了NF-κB活性。PDTC+40ug/ml NCTD组和40ug/ml NCTD组核蛋白NF-κBp65（1.06±0.01、1.42±0.01）及胞浆IκBα蛋白（0.62±0.01、0.85±0.01）相比进一步下降，pJNK蛋白（1.82±0.01、2.12±0.01）进一步上升，组间比较有统计学意义（P<0.05）；而JNK（1.98±0.01、1.98±0.01）的蛋白表达组间相比无统计学意义（P>0.05），这说明在NCTD诱导SMMC-7721凋亡过程中NF-κB抑制可能对JNK有激活作用（Fig4.1、4.2、4.3、4.4、Tabe5）。结论：1体外细胞培养研究表明，去甲斑蝥素可抑制SMMC-7721的增殖，其抑制作用具有一定时间和剂量依赖性。2去甲斑蝥素可诱导SMMC-7721凋亡。3SMMC-7721细胞中的NF-κB通路可以被去甲斑蝥素抑制，进而加速肝癌细胞的凋亡。4NF-κB的抑制可能促进了JNK通路的激活。