胰腺癌(pancreaticcarcinoma，Pca)是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，其恶性程度极高而且发病隐匿，难以早期诊断和治疗，临床确诊者大多属于晚期癌。胰腺癌的预后极差，5年生存率总体低于5％。除早期手术外，尚无其他有效治疗措施，而且由于很难早期诊断，只有大约14％的患者可以选择手术治疗。近年来胰腺癌发生率在国内外均呈逐年上升趋势，据报道，近十年发病率上升了3～7倍。1991年，Hrudan等统计，胰腺癌是美国地区肿瘤死亡原因的第四位，仅次于肺癌，结肠癌和乳腺癌。在我国，随着人们生活水平的提高，饮食结构的变化，胰腺癌的发病率从1980年的第二十上升到第五位。上海疾控中心2000年统计的胰腺癌发病率为每十万人有6人发病，其中5.5人死亡，发病率几乎接近于死亡率，这一数字触日惊心。 1988年，AlmogueraC发现，95％(21/22)的人类胰腺癌存在K-ras基因的第12密码子点突变。在以后的不断研究中，人们逐渐认识到，所有参与胰腺癌发生、发展的基因中，与胰腺癌关系最为密切的是K-ras基因。K-ras基因表达的ras蛋白被称为K-rasp21蛋白，K-rasp21蛋白作为鸟苷三磷酸腺苷酶(Guanosinetriphosphatase，GTPase)的作用与GTP或GDP结合，并使GTP水解为GDP和无机磷酸，是细胞外的信息通过受体向细胞内传递时的调制剂(Modulator)。K-ras基因第12密码子正常情况下为GGT，编码甘氨酸(glycin)。当这三个碱基发生突变，其表达的K-rasp21蛋白也发生改变，从而影响了细胞正常的信号传递，并在其他致癌因素作用下，使细胞发生癌变。胰腺癌是目前已知的K-ras癌基因突变率最高的恶性肿瘤，K-ras基因突变率高达70％～100％，其中95％的突变发生在第12位密码子。 转基因治疗的技术关键在于选择有效的目的基因即具有高选择性和高特异性的载体。近年来基础和临床研究大多应用cytokeine的插入以直接杀伤肿瘤细胞或诱导机体的局部或全身免疫反应以控制肿瘤的生长，或插入目的基因以消除异常基因的表达。载体主要有病毒性载体和非病毒性载体两大类。前者多用反转录病毒，腺病毒，或腺相关病毒；后者则多用脂质体，基因枪，或肿瘤内注射。 自从Johnston设计的氦动力基因枪问世并应用于动物细胞的基因转导以来，基因枪已成为医学研究中基因转导的一个重要手段之一。利用基因枪进行基因转导不仅具有方便，快速，效率高等优点，且对各种周期的细胞均能进行转导，不需要选择活跃增殖期的细胞，这就避免了病毒载体的局限性。1995年，WennHSun应用基因枪将白细胞介素-6转导入纤维肉瘤的鼠模型，明显控制了肿瘤的生长。1996年，Rakhmilevich建立了肾癌，淋巴瘤，肉瘤，黑色素瘤等6种肿瘤鼠模型，并应用基因枪分别进行白细胞介素-12基因转导，结果表明，5种肿瘤的生长达到明显抑制。基因枪的转基因治疗研究表明，基因枪对于临床肿瘤的vaccine的制备，以及直接临床转基因治疗的应用开辟了新途径，具有显著的临床应用价值。 本研究分以下三个方面： 第一部分：突变体富集法检测K-ras基因的第12密码子点突变 目的：检测三种胰腺癌细胞系K-ras基因第12密码子的突变特征，为设计和合成突变特异性K-ras反义基因及siRNA提供依据，同时探索突变体富集法在检测K-ras点基因突变中的应用价值。 方法：本实验采用两步巢式PCR，把K-ras基因第12密码子的突变序列扩增后酶切，酶切位点选择在第12密码子的第2个碱基，如果基因在这一位置发生突变，则无法酶切，这样突变的K-ras基因被保留，酶切产物再次扩增，突变基因的特征被数十倍放大，经琼脂糖凝胶电泳对胰腺癌细胞系BxPC-3(野生型)、AsPC-1(突变型)、MiaPaCa-2(突变型)进行突变特征检测，提高了K-ras基因突变的检测率。对三种胰腺癌细胞系K-ras基因突变特征进行DNA测序，并根据三种细胞系K-ras基因第12密码子的突变特征，分别设计、合成突变特异性的正义和反义Oligo，另合成一对随机Oligo。 结论：以上结果表明，两种突变型胰腺癌细胞系AsPC-1和MiaPaCa-2都存在K-ras基因第12密码子的点突变，野生型胰腺癌细胞系BxPC-3无K-ras基因突变。同时表明突变体富集法是一种灵敏有效的检测突变的方法，本实验不仅检验了突变体富集法检测突变的有效性，而且验证了其灵敏性。 第二部分：基因枪转导突变特异性K-ras反义基因抑制胰腺癌细胞系K-ras基因表达及细胞增殖的实验研究 目的：研究基因枪法对金粒子介导的裸DNA的基因转导效率；从基因和蛋白水平探讨基因枪转导突变特异性K-ras反义基因对胰腺癌突变型K-ras基因的静默作用，及对肿瘤细胞生长的抑制作用；为基因枪法转导K-ras突变特异性反义基因治疗胰腺癌提供实验数据。 方法：a.应用基因枪，将lacZ基因转导入胰腺癌细胞系，培养12小时后用X-Gal染色，检测基因枪转导裸DNA的转导效率；确定基因枪转导裸DNA的最佳条件；b.根据lacZ基因转导的最佳条件，用基因枪法把设计好的突变特异性K-ras反义基因转导入胰腺癌细胞系，培养24小时后提取总RNA和胞浆蛋白。c.应用RT-PCR和Westernblot方法，分别从基因和蛋白水平，检测基因枪转导K-ras突变特异性反义基因对胰腺癌细胞系突变型K-ras表达的抑制作用。d.做胰腺癌细胞系细胞爬片的K-rasp21蛋白免疫组化染色，从原位形态学角度探讨K-ras突变特异性反义基因对K-ras基因表达的抑制。e.应用CCK-8(cellcountingkit-8)活细胞计数法，绘制转基因前后细胞生长曲线，从细胞水平观察K-ras突变特异性反义基因的抑瘤效果。 结论：a.基因枪法是有效的基因转导方法，可用于肿瘤的转基因治疗。b.作为转基因研究的报告基因，1acZ基因可用于检测基因枪对DNA的转导效率。c.突变特异性K-ras反义基因，可明显下调突变型胰腺癌细胞系K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表达。d.突变特异性K-ras反义基因可明显抑制肿瘤细胞生长，从而达到胰腺癌转基因治疗的目的。 第三部分：基因枪转导突变特异性K-rassiRNA抑制胰腺癌细胞系K-ras基因表达及细胞增殖的实验研究 目的：研究基因枪对金粒子介导小片段双链siRNA的转导效率；从基因和蛋白水平探讨基因枪转导突变特异性K-rassiRNA对胰腺癌突变型K-ras基因表达的干扰作用，及对肿瘤细胞生长的抑制作用；为应用基因枪转导突变特异性K-rassiRNA，针对胰腺癌进行基因治疗，提供实验数据。 方法：a.根据三种胰腺癌细胞系K-ras基因测序，设计合成小片段双链的突变特异性siRNA；b.应用基因枪将标记有荧光素FAM的siRNA转导入胰腺癌细胞系，培养12小时后荧光显微镜下观察，确定基因枪对siRNA的转导效果；c.应用基因枪把突变特异性K-rassiRNA转导入胰腺癌细胞系，培养24小时后提取总RNA和胞浆蛋白；d.应用RT-PCR和Westernblot方法，从基因和蛋白水平检测基因枪转导突变特异性K-rassiRNA对突变型K-ras基因表达的干扰作用；e.行胰腺癌细胞系细胞爬片的K-rasp21蛋白免疫组化染色，从原位形态学角度，探讨突变特异性K-rassiRNA对K-rasp21蛋白表达的抑制作用；f.应用CCK-8(cellcountingkit-8)活细胞计数法，绘制转基因前后细胞生长曲线，观察突变特异性K-rassiRNA的抑瘤效果。 结论：a.基因枪可以有效地对小片段双链siRNA进行细胞内转导；b.突变特异性K-rassiRNA，可显著下调胰腺癌细胞系突变型K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表达，并能有效抑制肿瘤细胞的增殖。 结论： 1胰腺癌细胞系AsPC-1和MiaPaCa-2都具有K-ras基因第12密码子的点突变，野生型胰腺癌细胞系BxPC-3无K-ras基因突变。 2突变体富集法是一种灵敏有效的检测基因突变的方法，其较高的敏感性和特异性有望弥补目前胰腺癌临床诊断方法的不足。 3荧光素FAM标记的小片段siRNA和lacZ基因可以作为肿瘤转基因治疗研究的报告基因，检测基因枪的转导效率。 4基因枪法可以有效地转导裸DNA和小片段双链siRNA，可用于肿瘤的转基因治疗。 5突变特异性K-ras反义基因经有效转导后，可以显著下调K-ras基因突变型胰腺癌细胞系的K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表达，抑制胰腺癌细胞生长，可用于胰腺癌的转基因治疗。 6突变特异性K-rassiRNA经有效转导后可以显著下调K-ras突变型胰腺癌细胞系的K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表达，抑制胰腺癌细胞生长，可用于胰腺癌的转基因治疗。