论文部分内容阅读
番茄(Solanum lycopersicum L.)是世界范围内广泛种植的重要果菜类蔬菜,在设施栽培条件下,常常因授粉受精不良而导致结实异常,产量品质下降。单性结实(Parthenocarpy)是指不经过授粉受精作用而正常结实的现象,单性结实的果实因无籽而更受消费者青睐。长期以来,由于番茄单性结实种质资源稀缺,严重限制了通过传统育种方法对番茄单性结实性状进行有效改良。随着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的广泛运用,使得精准敲除特定基因成为可能。在前期研究中,我们在番茄单性结实的突变体中发现了 SlZHD17基因发生了突变,该基因编码含HD结构域的转录因子。本研究拟利用CRISPR/Cas9技术对番茄ZHD17基因进行定向敲除从而快速获得‘Alisa Craig’背景的单性结实株系,并通过酵母双杂交鉴定SlZHD17的互作蛋白,为后续研究SlZHD17基因调控番茄单性结实的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.从非单性结实番茄品种‘Alisa Craig’中克隆出了SlZHD17基因。组织表达分析表明,SlZHD17基因在未开放花芽中特异表达。将S1ZHD17-YFP融合蛋白在烟草中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察,发现S1ZHD17蛋白定位于细胞核。2.运用实验室已建立的番茄CRISPR/Cas9体系构建了SlZHD17的缺失突变体。将两段目的片段构建到相关载体上,转入农杆菌菌株LBA4404中,再通过农杆菌介导法将上述载体转入‘Alisa Craig’中。通过PCR鉴定和测序分析,共获得Cas9位点阳性植株37株,其中编辑成功植株33株,均具有单性结实表型,平均单性结实率为70%。3.构建了 pGBKT7-SlZHD17诱饵载体,转化AH109酵母菌株,经检测发现,该诱饵载体的表达无毒性,也不存在自激活现象。通过酵母双杂交实验,发现S1ZHD17与ZF-HD家族中的S1ZHD2/7/8/15存在互作。4.构建了SlZHD2/7/8/15的VIGS载体,采用真空渗透法侵染番茄,已成功获得SlZHD2/7/8/15的knock-down植株共12株用于验证单性结实表型。