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目的:通过观察人胎盘间充质干细胞外泌体(Human placental mesenchymal stem cell exosomes,hpMSC-EXO)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导致损的单层人肺毛细血管内皮细胞的作用,探究其对单层人肺毛细血管内皮通透性的影响。方法:(1)(1)体外扩增培养人胎盘间充质干细胞(hpMSCs)。(2)根据国际定义鉴定hpMSCs:光镜下观察hpMSCs生长形态,通过流式细胞技术检测人胎盘间充质干细胞表面特异性抗原的表达,将hpMSCs向中胚层细胞的三系诱导分化(成软骨、成骨、成脂诱导分化)。(3)利用ExoQuick外泌体提取纯化试剂组件分离、提纯人胎盘间充质干细胞培养上清中旁分泌外泌体(hpMSC-EXOs),并通过免疫印迹(Western blot,WB)及透射电镜分别检测、观察hpMSC-EXOs表面特异性抗原及hpMSC-EXOs的形态特征。(2)(1)检测外泌体的靶向转移:利用Transwell装置将Dil红色荧光探针标记的hpMSC-EXOs与正常的HPMVEC以及LPS诱导的HPMVEC进行共培养,在荧光显微镜下观察外泌体是否向HPMVEC中转移。(2)实验分组:构建hpMSCs、hpMSC-EXOs与人肺毛细血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMVEC)Transwell共培养体系,设置正常对照组(NC组)、脂多糖致损组(LPS组)、hpMSCs治疗组(hpMSCs+LPS组)、hpMSC-EXOs治疗组(exosomes+LPS组)。(3)模型制备及干预:四组共培养体系上室接种数量相等的HPMVEC,待细胞完全贴壁且100%融合形成单层人肺毛细血管内皮后,除正常对照组外,其余三组的HPMVEC用200 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预6 h;6 h后hpMSCs治疗组下室接种hpMSCs,hpMSC-EXOs治疗组下室加入人胎盘间充质干细胞外泌体,且四组共培养体系上下室全部更换为等体积无血清培养基,共培养时间为24小时。(4)检测外泌体:24小时后收集Transwell共培养正常对照组、脂多糖致损组、hpMSCs治疗组下室无血清培养基提取纯化外泌体,经透射电镜鉴定是否存在外泌体,并通过Western blot检测外泌体表面特异性抗原。(5)通透性测定:用FITC-dextran荧光蛋白渗透性实验测定四组共培养体系内单层人肺毛细血管内皮的通透性。Western blot实验测定各组人肺毛细血管内皮组织中钙粘蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin),紧密连接蛋白(claudin-1)以及细胞骨架蛋白(F-actin)表达量。结果:(1)(1)人胎盘组织来源的间充质干细胞于体外培养24小时后,在培养瓶内呈漩涡状贴壁生长,单个细胞呈梭状,形似纤维细胞。(2)人胎盘间充质干细胞表面抗原的表达,符合典型MSC免疫学表型:流式细胞术检测CD105、CD90、CD73呈强阳性表达;造血标记物CD34、CD45、CD14以及HLA-DR呈阴性表达。(3)hpMSCs向成脂、成骨、成软骨诱导培养21 d后,油红O染色、茜素红染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。(4)透射电镜下观察hpMSC-EXOs的形态呈杯口状或大饼状,直径介于30-100nm之间。(5)hpMSC-EXOs表达特异性抗原CD9、CD63。(2)(1)荧光显微镜下可观察到Dil红色荧光探针标记的hpMSC-EXOs可以向正常人肺血管内皮细胞内转移,但经LPS诱导的肺血管内皮细胞内红色荧光表达更为强烈。(2)Transwell共培养24小时后,收集NC组、LPS组与hpMSCs+LPS组下室无血清培养基提取外泌体,仅hpMSCs+LPS组在透射电镜下可观测到外泌体的存在,并可检测到其表面特异性抗原CD9、CD63的表达。(3)与NC组相比,LPS组FITC-dextran荧光蛋白表达强度明显增加(p<0.05);与LPS组相比,hpMSCs+LPS组、exosomes+LPS组FITC-dextran荧光蛋白表达强度明显减弱(p<0.05)。(4)与NC组相比,LPS组肺血管内皮细胞内VE-cadherin、claudin-1、F-actin蛋白表达量明显降低(p<0.05);与LPS组相比,hpMSCs+LPS组、exosomes+LPS组肺血管内皮细胞内VE-cadherin、claudin-1、F-actin蛋白表达量有所提高(p<0.05)。结论:人胎盘间充质干细胞可通过旁分泌外泌体降低LPS诱导致损的单层肺血管内皮通透性。