近年来随着人流、药流手术及宫腔操作的增多,导致子宫内膜基底部全部或部分缺损、变薄,使子宫前后壁粘连、宫腔闭锁,宫腔容积减小,引起患者月经改变和生育异常。因此,宫腔粘连已成为妇科常见病之一,并且成为不孕、流产、早产的一项重要原因。现阶段宫腔粘连尤其是重度粘连患者治愈率低下,手术分离后粘连易复发,严重影响着广大女性的身体及心理健康。因此宫腔粘连分离术后如何防止粘连复发、促进子宫内膜生长的治疗是临床工作的一大难题。目前,宫腔镜下宫腔粘连切除术(TCRA)是宫腔粘连治疗的标准术式,术后放置宫内节育器、宫腔放置球囊、应用生物胶及防粘连膜并配合人工周期药物治疗等方法对预防其再粘连有一定的临床疗效。然而中、重度宫腔粘连患者,宫腔内创面较大,正常内膜组织较少,更易再度形成粘连,以上方法对此类患者疗效欠佳。有学者利用羊膜移植治疗重度宫腔粘连,发现其能够促进子宫内膜再生从而降低宫腔再粘连的发生率。羊膜具有抗原性低、促进上皮化、减轻炎症反应、抑制纤维组织增生等作用,羊膜移植在眼表重建及皮肤移植中均有所应用,并取得了令人满意的效果。做为一种特殊的低免疫原性的物质,其拥有特殊的结构及分泌功能,新鲜羊膜中含大量生物活性物质,可以促进上皮细胞增殖分化,减少瘢痕形成及预防粘连等。目前羊膜已在各学科及手术领域广为发展。近年来,羊膜的临床应用范围逐渐扩大,包括眼科、烧伤科、骨组织重建、泌尿系统等等,而在妇科,羊膜可以作为一种生物敷料应用于阴道重建、宫颈形成,也有实验证实新鲜羊膜移植入IUA分离术后的宫腔,可以较好的降低宫腔再粘连的发生率,有很好的应用前景。目的本课题通过在新鲜羊膜基质面培养子宫内膜细胞,观察细胞在羊膜基质面的生长情况,并采用Real time-PCR及ELISA两种实验方法比较以羊膜为载体培养的子宫内膜细胞与体外正常培养液培养的子宫内膜细胞的肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶(MMP-9)及血管内皮因子(VEGF)的表达水平,初步探索以人羊膜作为载体种植人子宫内膜细胞的可行性,为探索子宫内膜重建提供有效和来源丰富的移植材料,并为探讨羊膜移植预防宫腔粘连分子机制积累实验数据。方法1.采用胶原酶消化及筛网过滤等方法体外分离培养人子宫内膜基质细胞,通过形态学观察及免疫组化法对培养的细胞进行鉴定;采用胰酶消化、机械刮除等方法制备去除羊膜上皮细胞的羊膜外基质支架。2.将体外扩增传代的子宫内膜细胞种植在去除羊膜上皮细胞的羊膜外基质支架上作为实验组,以无羊膜载体培养的子宫内膜细胞为空白对照组。倒置显微镜下观察两组细胞生长形态的变化,实时荧光定量PCR法测定各组细胞HGF、MMP-9、VEGF m RNA的表达水平,ELISA法测定各组细胞MMP-9蛋白表达量的变化。3.将实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示,不同组间m RNA及蛋白相对表达量符合正态分布的定量资料,两两比较采用采用两独立样本t检验,检验水准α=0.05。结果1.子宫内膜细胞形态学特点及免疫组化结果:培养出的子宫内膜细胞多为多角形,细胞两端有多个短小突起,细胞排列无极性,贴壁生长。随着细胞的传代培养,细胞逐渐拉长成梭形,具有成纤维细胞形态。细胞生长周期一般为7-10天,第1天为潜伏生长期,第2-4天进入对数生长期,5-6天后达平台期,7天后逐渐萎缩消退。子宫内膜基质细胞特异的波形蛋白抗体(Vimentin)染色呈阳性,阳性细胞的胞质呈棕黄色,角蛋白(CK19)抗体染色阴性。2.将第二代子宫内膜细胞接种于羊膜载体2h后,细胞粘附羊膜基质,呈小圆球状、散在分布、折光性较好,但尚未贴壁。12h后,细胞少量贴壁,逐渐聚集成团、成片生长,与培养皿上生长增殖的子宫内膜细胞形态相似,但细胞排列欠规则,细胞与细胞之间连接紧密,并有细胞拉长,相互交通呈网状。l周左右可观察到明显成片生长的细胞。羊膜载体在培养的第10天左右开始出现皱缩,细胞出现凋亡。3.在羊膜基质面培养的子宫内膜细胞,HGF m RNA含量为2.033±0.922,MMP-9 m RNA含量为1.356±0.399,VEGF m RNA含量为0.976±0.597;对照组m RNA HGF含量为1.299±1.004,MMP-9含量为0.871±0.529,VEGF含量为0.426±0.193;三组因子m RNA表达实验组均较对照组高,差异有明显统计学意义(P<0.05)。4.ELISA检测细胞裂解液MMP-9蛋白表达量,羊膜载体组为(0.762±0.085)ng/ml,对照组为(0.089±0.008)ng/ml,羊膜载体组较对照组MMP-9蛋白表达量高,差异明显有统计学意义(P<0.05)结论1.子宫内膜细胞在羊膜细胞外基质支架上能很好地生长,以羊膜为载体培养子宫内膜细胞具有一定的可行性。2.羊膜载体可以增强子宫内膜细胞HGF、VEGF、MMP-9的表达。3.羊膜移植为预防TCRA后宫腔再粘连提供新的思路与方法。