近年来,由于现代工农业的快速发展和人们保护环境意识的淡漠,包括有机锡化合物在内的大量有害物质通过陆源污染和海上污染等多种途径进入到海水中,给海洋环境造成了极大的破坏。这其中,三丁基氧化锡(TBTO)作为广泛应用于船体和渔网中的一种生物防附涂料,被认为是毒性最强的环境污染物和内分泌干扰物之一,其主要对水生生物的生长发育及体内组织和器官的功能造成较大影响,导致其大量死亡及繁殖力下降,严重威胁水生生物的种群资源及水产养殖业的发展,并可通过生物富作用,对人类健康造成极大威害。圆斑星鲽Verasper variegatus (Temminck et Schegel)和条斑星鲽Verasper moseri (Jordan et Gilbert)隶属于硬骨鱼纲(Osteicthys),鲽形目(Pleuronectiformes),鲽科(Pleuronectidae),星鲽属(Verasper),均为大型冷温性底栖名贵鱼种。近年来,其养殖规模逐渐扩大,创造了巨大的经济价值,但同样深受包括TBTO在内的多种污染物的毒害。而鱼类细胞系作为一种细胞毒理学的体外研究工具,广泛应用于对海水中各种污染物进行检测,并且其与利用活体鱼进行的体内检测相比具有经济、灵敏、快速等优点,因此迫切需要建立星鲽的组织细胞系进行细胞毒理学的体外研究。但到目前为止,仍未有成功建立星鲽组织细胞系的研究报道。为了建立星鲽的组织细胞系,本文分别采用0.5%透明质酸酶-0.2%Ⅱ型胶原酶联合消化和0.25%胰蛋白酶消化的方法对圆斑星鲽鳍组织和条斑星鲽鳃组织进行处理,并利用添加有50μg/mLN-乙酰葡萄糖盐酸盐、50μg/mL羧甲基壳寡糖、10ng/mL碱性成纤维样生长因子(bFGF)和40ng/mL I型胰岛素样生长因子(IGF-I)的含20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12、Leibovitz’s L-15和M199培养液(pH7.2)分别在18℃、22℃和26℃下进行了两种组织的体外培养。结果显示,圆斑星鲽鳍组织和条斑星鲽鳃组织的最适培养液均为含有上述添加物的20%FBS-DMEM/F-12 (pH7.2),最适培养温度均为22℃；在此最适条件下启动原代培养的结果显示,圆斑星鲽鳍组织和条斑星鲽鳃组织分别于启动培养7d和10d后便开始有细胞迁出,细胞形态均为成纤维样,生长分裂状态良好,并分别于第20d和第30d形成了汇合细胞单层；经传代后,两种组织细胞均能成功进行继代培养,圆斑星鲽鳍细胞现已传至第110代,条斑星鲽鳃细胞现已传至第70代,已成功建立了圆斑星鲽鳍细胞连续性细胞系(SHF01)和条斑星鲽鳃细胞的连续性细胞系(BFG01)。对两种细胞系细胞的生长特性分析结果显示,第60代圆斑星鲽鳍细胞和条斑星鲽鳃细胞的群体倍增时间分别为41.5h和54.4h,表明其生长分裂状态依然旺盛；对两种细胞系细胞的染色体分析结果显示,第60代两种星鲽组织细胞系细胞的染色体数目虽然出现了非整倍性,但其特征性染色体数仍均为46条。其中,圆斑星鲽鳍细胞系细胞具有46条染色体的比例为57.7%,并具有其典型的二倍体核型特征(46t),而条斑星鲽鳃细胞系细胞具有46条染色体的比例为68.3%,并具有其典型的正常二倍体核型特征(44t+2sm)。上述结果表明,本文所建立的两种细胞系确为圆斑星鲽鳍和条斑星鲽鳃连续性细胞系。为研究三丁基氧化锡(TBTO)对两种星鲽细胞系细胞的毒性作用,本文选取0.5-64 ng/mL的TBTO分别对上述两种细胞系细胞进行了处理,并通过二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法和蛋白含量测定法检测了TBTO对两种细胞系细胞的毒性作用。MTT染色和蛋白含量测定结果显示,0.5ng/mL TBTO即可对两种细胞产生毒性作用,并表现出明显的剂量-效应关系。经计算TBTO对圆斑星鲽鳍细胞的48h半数抑制浓度(48h-IC50值)分别为41.58 ng/mL和44.49 ng/mL,而对条斑星鲽鳃细胞的48h-IC50值分别为37.07 ng/mL和39.48 ng/mL;对TBTO处理的条斑星鲽鳃细胞的酶活性测定结果显示,40ng/mL TBTO可引起条斑星鲽鳃细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性显著变化。上述结果表明,TBTO对两种细胞系细胞的毒性作用具有浓度依赖性,其中条斑星鲽鳃细胞对TBTO的敏感性要高于圆斑星鲽鳍细胞,更适合用于TBTO的毒性作用研究,并且其SOD、GST和GSH-Px酶活性可以用作TBTO毒性作用的检测和评价指标。综上所述,本文成功建立了圆斑星鲽鳍和条斑星鲽鳃的连续性细胞系,发现条斑星鲽鳃细胞对TBTO具有更高的敏感性,其SOD、GST和GSH-Px可以用作TBTO毒性作用的检测和评价指标。本文研究结果为进一步研究TBTO对星鲽细胞毒性作用的机理奠定了基础,不仅对环境毒理学的体外研究具有重要的理论意义,而且对符合国家标准、快速灵敏的有机锡污染物毒性检测体系的建立还具有重要的理论指导价值。