人类妊娠的成功建立由胚胎着床、胎盘形成及发育等多因素参与调控。滋养细胞是构成胎盘组织的主要成分，在胚胎植入、胎盘形成和成功妊娠过程中起重要作用。滋养细胞来自妊娠初期的胚胎外胚层，随着妊娠的进行形成绒毛滋养层和绒毛外滋养层（EVTs）。绒毛滋养层细胞可形成绒毛膜绒毛，其作用为运输营养物质给胎儿；而绒毛外滋养细胞侵入蜕膜组织、侵入血管内皮、重建螺旋动脉，引起螺旋动脉收缩性的丧失，使足够的母体血流进入绒毛间，其作用为维持胎盘正常的生理功能。滋养细胞与肿瘤细胞的侵袭转移具有相似性，不同的是滋养细胞的侵袭性受到精细调控，具有严格的时空限制。研究表明，胎盘形成过程中滋养细胞侵袭功能障碍会引起各种产科并发症包括：流产、胎儿生长受限、子痫前期等。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）具有多种生物学作用，其表达失调与诸多产科疾病的发生和转归密切相关，并且对肿瘤细胞的侵袭性也有重要的调节作用。IL-6与白细胞介素-11（interleukin-11，IL-11）、白血病抑制因子（leukemiainhibitory factor，LIF）均属于IL-6超家族成员。IL-11、LIF被证实可以通过激活STAT3信号转导通路而调节滋养细胞的侵袭功能。然而，IL-6对滋养细胞侵袭性的调节作用一直没有定论。众所周知，细胞侵袭功能的实质是蛋白酶对组织的水解作用。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一类锌依赖性蛋白水解酶，经激活可降解细胞外基质的多数成分。在妊娠过程中，子宫基底膜是阻碍细胞侵袭的主要结构屏障，而MMP-2和MMP-9能分解基底膜的主要成分（Ⅳ型胶原），因此被认为是胎盘植入子宫过程中的关键酶，可调节滋养细胞的侵袭、迁移功能。然而目前调控滋养细胞侵袭力的具体机制尚未被完全阐明，其中涉及复杂的细胞信号转导途径，如JAK/STAT信号转导通路等。最近研究显示，在乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞的研究中，信号转导与转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）可能作为信号通路的上游因子，通过调节细胞MMP-2的表达来参与调控其侵袭功能。人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞具有与滋养细胞相似的分子结构，可作为研究滋养细胞侵袭功能的模型。本文在研究IL-6对滋养细胞系JEG-3细胞侵袭力的影响及相关信号转导分子的基础上，探讨IL-6作用于滋养细胞的分子机制，为明确部分妊娠期相关疾病的发病机制奠定基础，对疾病预防、诊断、治疗进行全方位指导，保护母婴健康。目的本研究通过分析人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞在IL-6和SD-1008处理前后STAT3、p-STAT3、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达的差异，利用transwell和MTT实验分析不同浓度的IL-6对滋养细胞侵袭力的调节作用，初步探讨IL-6是否通过STAT3信号转导通路调控MMP-2、MMP-9的表达或者激活，而影响滋养细胞的侵袭功能。材料和方法1研究对象从北京鼎国昌盛生物科技购入JEG-3细胞系，使用高糖完全培养基（DMEM-H、10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，选择对数生长期的JEG-3细胞进行干扰试验。2方法利用含10%FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM-H完全培养液，将JEG-3细胞悬浮后放进37°C、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱进行培养。通过分析细胞的生长曲线，将对数生长期细胞按照1.5×106/孔的浓度，接种于6孔细胞培养板，放置于培养箱孵育24h。然后，按照不同冻存批次将JEG-3细胞进行配对分组：对照组、STAT3磷酸化抑制剂（5μM SD-1008）处理组和IL-6处理组，采用transwell实验和MTT实验检测细胞的侵袭力、增殖力的变化。同时提取相应细胞的mRNA和蛋白，采用免疫印迹实验（Western Blot）和实时荧光定量PCR实验（Real time-PCR）检测细胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）、MMP-2、MMP-9表达水平的变化。按照配对设计原则，分析IL-6对JEG-3细胞侵袭功能的调控作用并探索其分子机制。3统计学处理本研究中所有数据均采用SPSS17.0版本软件进行统计学分析处理，数据均以x s的方式表示。当数据符合正态分布时采用配对设计定量资料的t检验，不符合正态分布时采用配对设计定量资料的符号秩和检验，以α=0.05为检验水准。结果1IL-6对滋养细胞系JEG-3细胞侵袭、增殖行为的影响Transwell实验结果显示：经10ng/ml IL-6孵育36h的JEG-3细胞的侵袭数量（72.41±17.35）高于对照组（49.17±13.15）（P<0.05），并采用10ng/ml作为研究IL-6作用机制的后续实验的最佳浓度。采用MTT实验对JEG-3细胞的增殖变化进行检测，结果显示：IL-6（10ng/ml）处理组JEG-3细胞与对照组相比，无统计学差异（P>0.05）。2p-STAT3抑制剂对滋养细胞系JEG-3细胞MMPs表达的影响本研究采用STAT3磷酸化抑制剂（SD-1008）抑制JEG-3细胞中STAT3磷酸化，探索JAK/STAT3信号通路对MMPs表达的影响。与对照组（0.17±0.02）相比，经SD-1008处理后的JEG-3细胞中pSTAT3的表达水平（0.06±0.02）明显降低（P<0.05），而STAT3蛋白的表达量无明显差异（P>0.05）。SD-1008处理组JEG-3细胞MMP-2mRNA水平（0.42±0.24，P<0.05）低于对照组（1.03±0.12）；同样，SD-1008处理组JEG-3细胞中MMP-9mRNA水平（0.48±0.21，P<0.05）也明显低于对照组（1.05±0.09）。在免疫印迹实验中，SD-1008处理组中MMP-2和MMP-9蛋白水平与mRNA一致，均明显低于对照组（P<0.05）。3IL-6对滋养细胞系JEG-3细胞中p-STAT3表达水平的影响基于p-STAT3抑制剂处理组JEG-3细胞的MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平明显降低，本研究在不同时间点检测了IL-6（10ng/ml）对JEG-3细胞（预先在无血清培养基中饥饿培养6h）中STAT3磷酸化水平的影响。结果显示：IL-6处理组JEG-3细胞中STAT3磷酸化水平与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。4IL-6对滋养细胞系JEG-3细胞中MMPs表达的影响Real-time PCR实验显示：与对照组相比，经IL-6（10ng/ml）孵育处理24h的JEG-3细胞中MMP-2和MMP-9mRNA的表达水平均无统计学差异（P>0.05）。在免疫印迹实验中，采用的兔抗人MMP-2单克隆抗体可特异性地检测MMP-2的活性形式（66kDa）和酶原前体形式（72kDa），采用的小鼠抗人MMP-9多克隆抗体特异性地检测MMP-9（92kDa）的酶原形式和活性形式（84kDa）。结果显示：与对照组细胞相比，JEG-3经IL-6（10ng/ml）孵育处理24h后，proMMP-2、proMMP-9的表达水平均无统计学差异（P>0.05）；但与对照组（0.5±0.11）相比，IL-6处理组细胞中MMP-2的活化形式水平（0.78±0.18）明显增加（P<0.05），因MMP-9活化形式的灰度值过低而无法对其表达进行分析。结论STAT3作为信号转导通路中的上游因子参与调控滋养细胞中MMP2、MMP-9的表达水平，但是IL-6并未通过此通路调节滋养细胞的侵袭力，而是可能通过刺激MMP-2的活化增强滋养细胞的侵袭功能。