[目 的]间充质干细胞能够发挥免疫调节、促血管生成、促进创面愈合和组织修复的作用,是再生医学的理想候选者。然而其临床应用受限于由内、外源性氧化应激损伤导致的细胞凋亡。哺乳动物Sirtuins（SIRT1-7）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）依赖性酶家族,该家族对组蛋白去乙酰化和蛋白质翻译后的修饰至关重要。SIRT3作为Sirtuins蛋白家族中定位于线粒体基质中的去乙酰基酶,可通过调节线粒体内三磷酸腺苷和活性氧的产生,在缓解氧化应激损伤引起的细胞凋亡和调节细胞内自噬途径中起到关键作用。但是SIRT3在氧化应激损伤时间充质干细胞中的作用尚未完全明确,仍有待进一步研究。自噬是细胞抵抗内源性和外源性应激的生存机制之一,对维持细胞稳态至关重要。尽管近年来的研究对提高间充质干细胞移植后的存活率取得了一些进展,然而,SIRT3是否通过调控人脐带间充质干细胞的自噬对抗氧化应激损伤,发挥细胞保护作用仍然是未知的。本实验将人脐带间充质干细胞作为研究对象,通过体外分离、培养人脐带间充质干细胞,观察细胞的形态、生物学功能及表型特征,探究过氧化氢诱导体外氧化应激损伤对人脐带间充质干细胞存活率的影响以及SIRT3对人脐带间充质干细胞存活率、活性氧产生及自噬的影响,并初步阐明SIRT3在发挥内源性细胞保护作用中的方式及潜在机制。[方 法]1、从离体的人体脐带组织,提取脐带间充质干细胞。观察细胞形态及贴壁生长状态。应用流式细胞术,对细胞的免疫表型进行鉴定。应用体外成脂成骨诱导分化实验,鉴定细胞分化能力。2、应用不同浓度的过氧化氢对人体脐带来源的间充质干细胞干预3小时,以建立体外细胞氧化应激损伤模型。应用CCK-8法、流式细胞术、蛋白免疫印迹实验,检测人体脐带来源的间充质干细胞在氧化应激损伤模型中的存活率,凋亡相关蛋白的表达情况,探究不同浓度过氧化氢对细胞的存活率和凋亡的影响。3、应用活性氧生成检测实验、免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验,探究基于氧化应激损伤的环境下,细胞内活性氧产生、SIRT3以及自噬水平的表达变化。4、应用质粒转染技术过表达SIRT3,检测过表达SIRT3后细胞内活性氧产生、凋亡率、自噬水平以及AMPK/mTOR通路蛋白的表达变化,探究SIRT3在氧化应激损伤中的作用及机制。[结 果]基于本实验的结果,我们发现:1、离体的人脐带组织中提取的人脐带间充质干细胞纯度高。2、不同浓度的H2O2干预细胞3小时,抑制人体脐带来源的间充质干细胞存活,提高细胞凋亡率,促进Bax、Caspase-3蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达。3、氧化应激损伤导致细胞内活性氧产生增多,SIRT3表达水平和自噬表达水平（Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ）降低。4、质粒转染过表达SIRT3后,可显著降低氧化应激损伤时人脐带间充质干细胞的活性氧过量产生,抑制细胞凋亡率、抑制Bax、Caspase-3蛋白的表达,促进Bcl-2蛋白的表达。5、过表达SIRT3激活了氧化应激损伤时人脐带间充质干细胞的自噬,表现为Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ表达增高。6、氧化应激损伤时,AMPK磷酸化水平降低,mTOR的磷酸化水平增高。7、SIRT3在人脐带间充质干细胞内过表达后,AMPK磷酸化水平有所增加,mTOR的磷酸化水平降低。8、应用AMPK的抑制剂Compound C后,可以降低SIRT3的保护作用。[结 论]氧化应激损伤可以导致人体脐带来源的间充质干细胞存活率降低并且细胞内活性氧产生增多,SIRT3和自噬表达水平降低,细胞发生凋亡。SIRT3可以作为细胞的内源性靶点因子,在细胞遭到氧化应激损伤时减少活性氧产生,抑制凋亡蛋白表达,激活细胞自噬,从而发挥抑制细胞凋亡的保护作用,这种作用是通过AMPK/mTOR通路激活细胞自噬实现的。