柑橘黄龙病（HLB）严重影响柑橘产量及品质,能危害几乎所有商业化种植的柑橘品种,是柑橘生产上的重大病害。该病害主要由候选韧皮部杆菌亚洲种引起（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）。由于病原菌无法纯培养,传统的分子和遗传技术难以应用,所以一度限制了病原-寄主互作机制的研究。随着测序技术的发展,黄龙病菌基因组信息日渐丰富,为后续的研究开辟了新途径。通过分析CLas全基因组序列,发现黄龙病菌没有典型的Ⅲ型或Ⅳ型分泌系统,但具有I型分泌系统和完整的Sec分泌系统,同时筛选到许多候选分泌蛋白。目前,绝大部分分泌蛋白的生物学功能及其与寄主互作靶标仍未明确。因此,有必要对CLas的分泌蛋白进行筛选、鉴定和功能研究,从而为解析效应子与寄主蛋白互作,揭示黄龙病菌致病机制奠定基础。前期研究表明,ES40（CLIBASIA＿04405）成熟蛋白m ES40能完全抑制INF1、Bax诱导的细胞程序化死亡（PCD）及H2O2积累,其表达水平与寄主植物抗病能力呈正相关。为进一步鉴定效应子ES40调控的柑橘寄主靶标,本研究首先通过酵母双杂交筛选ES40在甜橙寄主中的互作蛋白,然后对初筛得到的阳性克隆进行菌落PCR、测序以及一对一酵母回转鉴定,最后利用双分子荧光互补验证ES40与靶标蛋白在烟草系统中的互作。主要研究结果如下:1.成功构建诱饵载体BD-ES40。参考柑橘黄龙病菌假定蛋白ES40的核苷酸序列（Gen Bank:ACT57453.1）,构建了诱饵表达载体BD-ES40。毒性与自激活检测结果表明,诱饵蛋白ES40不影响酵母的生长且无自激活效应,可进行后续文库筛选。2.通过酵母双杂交技术（Y2H）从甜橙c DNA文库中筛选到25个与ES40互作的候选蛋白。首先对文库质量进行鉴定,文库一滴度为2.04×10~7 cfu/m L,文库二滴度为7.3×10~6 cfu/m L,均可用于后续筛选。两个文库杂交效率分别为4.8%和2.3%,表明酵母杂交状态良好。经过mating法筛选、菌落PCR鉴定及测序比对,最终得到25个与ES40互作的候选蛋白。3.利用一对一酵母回转验证了8个与ES40在异源酵母系统中有互作的蛋白。克隆25个候选蛋白全长序列,构建猎物表达载体,并与诱饵表达载体BD-ES40共转入Y2H Gold酵母细胞中,进行一对一酵母回转验证。结果表明,自噬相关蛋白ATG8C（autophagy-related protein 8C）、半胱氨酸蛋白酶RD21A（cysteine proteinase RD21A）、异丙基苹果酸脱氢酶IPMDH（3-isopropylmalate dehydratase small subunit 3（P））、转录因子TCP20（transcription factor TCP20-like（P））、响应乙烯的转录因子ERF107（ethylene-responsive transcription factor ERF107）、磷酸甘油酸激酶PGK（phosphoglycerate kinase）、莽草酸激酶SK1（shikimate kinase 1）、鲨烯合酶SQS（squalene synthase）这8个候选蛋白能与诱饵蛋白ES40发生互作。4.通过双分子荧光互补技术验证了2个与ES40在烟草系统中互作的蛋白。构建8个候选蛋白的双分子荧光互补载体,在本氏烟中利用农杆菌介导法瞬时表达3 d后,在激光共聚焦显微镜下观察叶片表皮中的荧光信号。结果表明,自噬相关蛋白ATG8C（autophagy-related protein 8C）和半胱氨酸蛋白酶RD21A（cysteine proteinase RD21A）与诱饵蛋白ES40发生互作。