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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中老年人常见的神经系统变性性疾病。目前PD的治疗措施主要是多巴胺(dopamine,DA)替代疗法,只能缓解患者临床症状,尚缺乏安全有效的延缓或改变PD病程进展的神经保护治疗措施。研究表明,?-synuclein错误折叠、异常积聚导致的DA能神经元细胞功能紊乱是PD神经细胞变性死亡的主要机制。通过诱导自噬,促进错误折叠或异常积聚的?-synuclein蛋白清除,可能有希望延缓或改变PD的病程进展。白藜芦醇(resveratrol,RV)是一种非黄酮类天然多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、清除自由基、保护心脑血管等多种生物活性,且较易透过血-脑屏障进入脑组织。最近有研究证实,RV可能对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)导致的DA能神经元损伤具有保护作用。我们的前期研究也发现,RV能减轻线粒体神经毒素鱼藤酮导致的SH-SY5Y细胞的凋亡,能降低?-synuclein过表达PC12细胞内?-synuclein的沉积,并且RV发挥上述作用可能与激活沉默信息调节蛋白1(silent information regulation 2 homolog 1,SIRT1)有关。为深入探讨RV在活体内的作用效果和途径,我们建立MPTP亚急性PD小鼠模型,用RV灌胃、SIRT1特异性抑制剂EX527腹腔注射进行干预,在MPTP造模前及造模后的不同时间点进行行为学测试(包括开场试验、足迹试验和爬杆试验)检测其行为学改变,利用高效液相色谱电化学法(high performance liquid chromatography with electrochemical detection,HPLC-ED)检测DA及其代谢产物变化,采用免疫荧光技术、western blot技术及蛋白质免疫共沉淀技术检测相关蛋白表达变化。从行为学改善和对黑质纹状体多巴胺系统的保护作用两个角度观察RV对PD小鼠的保护作用,证实其有保护作用后,再对其可能的作用机制进行探索。本课题主要从以下两个部分展开:第一部分,白藜芦醇调控AMPK-SIRT1通路对MPTP帕金森病小鼠的神经保护作用研究。我们发现,RV可以显著改善MPTP小鼠的行为学损伤、DA水平下降、黑质区TH阳性神经元丢失及纹状体区TH蛋白表达减少。为了探索RV发挥保护作用的可能机制,我们在给予RV灌胃时,同时腹腔注射SIRT1特异性抑制剂EX527。我们发现,给予RV后,小鼠黑质区SIRT1免疫荧光及纹状体区SIRT1蛋白表达均较MPTP组显著升高,同时p-AMPK蛋白表达较MPTP组亦显著升高。而给予EX527后,小鼠黑质区SIRT1免疫荧光及纹状体区SIRT1蛋白表达较RV+MPTP组显著下降,伴随着p-AMPK含量较RV+MPTP组显著降低。同时,在给予EX527后,小鼠的行为学、DA水平、黑质区TH阳性神经元及纹状体区TH蛋白较RV+MPTP组显著下降。提示RV对MPTP帕金森病小鼠的保护作用可能是通过激活SIRT1,进而激活AMPK而获得。而我们前期的细胞实验抑制AMPK磷酸化后,抑制了SIRT1活性。共同说明SIRT1与AMPK存在相互调控关系,且这种相互调控关系可能介导了RV对MPTP小鼠DA能神经元的神经保护作用。通过以上实验,我们证明RV可能通过激活AMPK-SIRT1信号通路,SIRT1与AMPK相互调控,改善了MPTP小鼠行为学损伤,减轻了MPTP小鼠DA水平下降,减少了黑质区TH阳性神经元丢失及纹状体区TH蛋白减少。第二部分,SIRT1去乙酰化LC3介导的自噬在?-synuclein降解中的作用。我们首先利用western blot技术检测LC3-II、p62等自噬标志蛋白及?-synuclein,并采用免疫荧光双标共定位p62和?-synuclein。我们发现在MPTP组,SIRT1水平较对照组显著降低,伴随着p62和?-synuclein共同积聚在胞浆中;而当给予RV激活SIRT1后,LC3-II水平升高,共同积聚在细胞内的p62和?-synuclein较MPTP组显著减少;当同时给予SIRT1特异性抑制剂EX527后,SIRT1水平下降,此时,LC3-II水平较RV+MPTP组显著下降,与此同时,p62和?-synuclein共同积聚在胞浆。该实验结果与我们课题组的前期细胞实验共同证实RV激活SIRT1后,SIRT1可通过进一步诱导自噬,促进?-synuclein降解,进而减轻MPTP小鼠病理学损害和行为学损伤。为了进一步探索SIRT1对自噬的可能调控机制,我们采用蛋白质免疫共沉淀技术检测LC3乙酰化水平及免疫荧光双标?-synuclein和LC3观察两者相对亚细胞定位。我们发现,MPTP小鼠中SIRT1表达较对照组小鼠显著下降后,LC3乙酰化水平较对照组显著升高,与此同时,LC3主要表达在细胞核内,伴随着?-synuclein积聚在胞浆内。当给予小鼠RV后,SIRT1表达较MPTP组显著升高,LC3乙酰化水平较MPTP组显著下降,与此同时,LC3主要表达在胞浆中,积聚在胞浆内的?-synuclein被大量降解。给予SIRT1特异性抑制剂EX527后,我们观察到LC3乙酰化水平较RV+MPTP组显著升高,而与此同时,与MPTP组类似,LC3主要表达在胞核,伴随着?-synuclein积聚在胞浆内。通过以上实验,我们证实,SIRT1可能通过去乙酰化LC3,可以使LC3从胞核转运至胞浆,进而诱导自噬,是RV对MPTP帕金森病小鼠发挥保护作用的一条重要途径。