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骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种富集于骨髓腔中的干细胞群体,再生活性较强,具有多向分化能力。移植BMSCs已经被公认为是一种防治神经退行性疾病的极具潜力的方法。中药黄芪是传统的补虚上品,增强免疫能力,加速代谢活动,防止细胞氧化,去除氧自由基以及延缓衰老,用于治疗老年退行性疾病具有优势。黄芪甲苷Ⅳ是黄芪经分离提纯后所得的皂苷类成分之一,生物活性较强,其在体外可以促进神经细胞的再生以及保护神经细胞。β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol,βME)具有诱导BMSCs向神经细胞方向分化的能力,是一种公认的化学诱导剂。在本实验中,主要通过提取小鼠BMSCs,并对其进行培养纯化与鉴定,分别通过中药及化学诱导剂诱导其为神经细胞,并检测相关基因及蛋白的表达情况,为下一步应用BMSCs治疗老年退行性疾病提供基础。本研究将首次探讨黄芪甲苷Ⅳ、βME及黄芪甲苷Ⅳ+βME联合方法分别诱导小鼠的BMSCs向神经细胞分化过程的相关标志分子表达。首先在小鼠骨髓腔中无菌分离出BMSCs,利用全骨髓贴壁的传统培养法对其进行培养,经传代纯化细胞。通过流式细胞技术检测第3代细胞的表面抗原CD29、CD34以及CD90的表达情况,鉴定所养细胞为BMSCs。每天在倒置显微镜下观察每一代的BMSCs的形态及其变化,利用MTT法检测在7天期间内P1-P6代BMSCs的细胞活性的变化。然后分别采用黄芪甲苷Ⅳ、βME及黄芪甲苷Ⅳ+βME联合方法诱导BMSCs分化为神经细胞,通过扫描电镜观察BMSCs诱导前及诱导后的形态学变化;采用免疫荧光技术对诱导组及对照组进行神经元性特异性烯醇化酶(NSE)和神经巢蛋白(Nestin)表达情况的检测;利用RT-qPCR技术检测诱导组及对照组的NSE和Nestin,Wnt3a、Axin和β-catenin以及Notch-1基因的表达;采用Western blot技术对诱导前后的Wnt3a和β-catenin以及Notch-1蛋白的表达情况进行检测。结果显示,倒置显微镜下观察刚提取出的BMSCs呈椭圆形,经过培养传代纯化,第3代大部分细胞呈长梭形。流式细胞技术检测BMSCs CD29(+),CD34(-),CD90(+),确定其为BMSCs。MTT法结果显示BMSCs培养至第3代时OD值最高,细胞活性最好,可用于后续实验。扫描电镜下观察,可见黄芪甲苷Ⅳ、βME及联合诱导组均可以促进BMSCs向神经细胞分化,βME组和联合诱导组细胞膜部分有损伤。免疫荧光技术结果显示,黄芪甲苷Ⅳ诱导后的NSE和Nestin蛋白表达均高于对照组、βME和联合诱导组(P<0.01)。RT-qPCR技术检测结果表明,与对照组相比,黄芪甲苷Ⅳ、βME以及联合诱导组的NSE和Nestin,β-catenin、Axin和Wnt3a基因的表达较高(P<0.01);而Notch-1基因的表达较低(P<0.01);Western blot检测结果发现,黄芪甲苷Ⅳ、βME及联合诱导组的Wnt3a、β-catenin蛋白表达均高于对照组(P<0.01);Notch-1蛋白在黄芪甲苷Ⅳ、βME及联合诱导组中均低于对照组(P<0.01)。综上,我们通过实验证实,黄芪甲苷Ⅳ诱导组、βME诱导组以及联合诱导组均能成功诱导BMSCs分化为神经细胞,并且黄芪甲苷Ⅳ组诱导效果优于βME诱导组以及联合诱导组;黄芪甲苷诱导BMSCs分化为神经细胞的机制主要是通过高表达β-catenin蛋白和基因,激活wnt通路,降低Notch-1基因和蛋白的表达,沉默Notch通路,促进BMSCs分化为神经细胞。