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活化转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)是内质网应激三条信号通路中内质网激R样激酶(Endoplasmic reticulum-resident kinase,PERK)通路下游的信号分子。ATF4在个体发育、细胞应激反应、氨基酸分泌、细胞凋亡及肿瘤发生等多方面发挥着重要的作用。目前,关于ATF4基因是否参与奶乳腺发育调控的报道鲜有。本实验选取奶牛乳腺泌乳中期的细胞为研究模型,利用分子生物学技术探究ATF4基因的表达对奶牛乳腺发育及泌乳的影响。旨在探索ATF4基因调节乳腺发育和泌乳的分子机制,为丰富乳腺发育和泌乳调节网络、提高乳品质及增加乳产量提供理论依据。本研究应用激光共聚焦及q RT-PCR技术检测青春期、泌乳期和干奶期健康的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中ATF4的表达及定位,以鉴定ATF4在奶牛乳腺发育各时期的表达差异及定位。选取泌乳期奶牛乳腺体外组织分离培养的上皮细胞作为实验材料,利用基因干扰技术对细胞进行ATF4基因沉寂实验。ATF4基因干扰后,利用相关方法检测泌乳相关信号通路基因的表达,乳腺上皮细胞增殖和细胞活力的变化,以及甘油三酯的分泌情况。本实验通过免疫共沉淀技术(Co-immunoprecipitation,co-IP)研究ATF4与重要的泌乳调控蛋白m TOR的相互作用关系,同时ATF4基因干扰并添加m TOR信号通路抑制剂雷帕霉素共同处理乳腺上皮细胞,检测泌乳相关信号通路基因和氨基酸转运载体CHAC1等的表达变化以及甘油三酯的分泌情况。为进一步确定ATF4对氨基酸转运载体的调控作用,实验通过co-IP技术研究ATF4与转录相关的调节蛋白之间的相互作用关系。同时对奶牛乳腺上皮细胞ATF4基因进行沉寂并氨基酸饥饿处理,验证其与转录相关的调节蛋白之间的作用关系,探究ATF4对氨基酸转运载体的表达调控。激光共聚焦检测结果显示ATF4主要在奶牛乳腺组织乳腺上皮细胞的细胞质中表达,青春期和泌乳期乳腺组织中高表达,干奶期乳腺组织表达较低,结果提示ATF4可能参与奶牛乳腺发育和泌乳的调节。本实验进一步检测ATF4干扰后对乳脂合成、乳蛋白合成、细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,PPAR-γ、SREBP-1、β-酪蛋白蛋白表达下降,Caspase3蛋白表达升高,m TOR蛋白表达差异不显著。细胞活力显著减弱。此外,ATF4抑制的乳腺上皮细胞增殖率显著低于空白对照组和阴性对照组,且Cyclin D1蛋白的表达较对照组显著降低,说明ATF4可能参与调控乳腺细胞泌乳和细胞增殖。本实验通过co-IP技术确定ATF4与m TOR之间存在相互作用。随后,本实验进行ATF4干扰并添加雷帕霉素处理乳腺上皮细胞。结果显示,单独抑制m TOR活性时,ATF4蛋白表达下降,同时PPAR-γ、SREBP-1、β-酪蛋白和Cyclin D1蛋白表达下降,Caspase3蛋白表达升高。当抑制m TOR活性同时干扰ATF4时,PPAR-γ、SREBP-1、β-酪蛋白和Cyclin D1的蛋白质表达显著降低,Caspase3蛋白表达显著升高。以上实验结果表明,m TOR-ATF4可调控乳脂、乳蛋白合成、细胞增殖及细胞凋亡。实验结果还显示,当乳腺上皮细胞中ATF4被抑制并添加雷帕霉素共同处理细胞时,细胞内CHAC1等氨基酸转运载体的m RNA表达均显著下调。为进一步确定ATF4调控氨基酸转运载体表达的机制,实验通过co-IP确定细胞在正常培养时,ATF4与转录因子核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)相互作用,调控氨基酸转运载体的表达;营养缺乏时,ATF4与调节机体稳态的蛋白哺乳动物去乙酰化酶6(Sirtuin 6,SIRT6)相互作用,下调控氨基酸转运载体的表达;然而当内质网应激时,ATF4的表达量开始急剧上升,不与SIRT6或NRF2蛋白发生作用,此时ATF4不参与氨基酸转运载体的调控。综上所述,奶牛乳腺上皮细胞正常泌乳、增殖需要m TOR-ATF4的调节,ATF4在调控氨基酸转运载体的表达方面发挥重要的生物学作用。