全球肝细胞癌的每年新发病例数约为84万,而死亡病例则高达每年78万,其肿瘤相关死亡率在恶性肿瘤中排名前三。这不仅由于晚期肝癌向远端转移的倾向更高,有效治疗手段和药物的缺乏也是导致其不良预后的主要原因。寻找对晚期肝癌安全有效的治疗方案是肝癌研究中亟待解决的难题。在不断探索新的分子靶向药物和免疫治疗的同时,“老药新用”的策略不失为一个更具疗效指向性、更低成本、更高成功率的探索思路。在晚期肝癌的临床研究中,传统中药三氧化二砷(Arsenic Trioxide,ATO)的经验性使用最终被证实疗效显著便是一个成功的案例。三氧化二砷是被中国及美国FDA批准的治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)的一线用药,由于其作用靶点明确,作用方式直接,使得这一血液系统恶性肿瘤得到了高达90%的治愈率。在后续诸多实体瘤的临床试验中,三氧化二砷对晚期肝癌患者表现出了良好的治疗效果。但与其在白血病中的作用机制非常明确不同,三氧化二砷对晚期肝癌的作用靶点及其机制尚未得到阐明,这在一定程度上限制了其应用的安全性和疗效的提高。由于晚期肝癌通常伴有转移,肿瘤细胞侵犯门静脉、局部淋巴结,或远端器官。而越来越多的研究表明转移发生的元凶是肿瘤组织中的一小群处于更高层级的、具有高度自我更新及多向分化能力的、可以在转移部位重建肿瘤组织的肿瘤细胞,这一小群细胞被定义为“肿瘤干细胞”(Cancer Stem Cells,CSCs)。根据三氧化二砷的分子特性和临床经验性使用的疗效特征,我们推测三氧化二砷在晚期肝癌的治疗作用可能与抑制肝癌干细胞有关。因此,本研究主要围绕三氧化二砷是否抑制肝癌干细胞以及如何调控肝癌干细胞等系列问题展开探索。首先为了论证三氧化二砷是否对肝癌干细胞发挥调控作用,我们利用多种动物模型,包括小鼠皮下成瘤模型、二次移植模型及肝脏原位荷瘤肺转移模型,考察三氧化二砷对肝癌干细胞体内功能的影响。结果显示三氧化二砷可以在动物体内抑制肝癌干细胞介导肿瘤启动、肿瘤复发及远端转移的能力,甚至可以在肝癌肺转移小鼠模型中将小鼠的中位生存时间从32天延长至41天,显著改善小鼠生存状态;之后我们利用多个肝癌细胞系,以及通过肿瘤干细胞表面标志富集或通过肿瘤成球富集得到的肝癌干细胞样细胞,进一步探究了三氧化二砷在体外对肝癌干细胞相关表型及功能的作用,包括流式细胞术检测肿瘤干细胞表面标志、实时定量PCR检测干性基因的表达,耐药性质、肿瘤干细胞球形成能力以及Transwell侵袭能力的评估等。最终证实了三氧化二砷可以抑制肝癌干细胞相关的多种特性与功能。在上述结论的基础上,为了探讨三氧化二砷发挥作用的分子机制,我们进一步利用高通量基因芯片检测,筛选鉴定三氧化二砷作用于肝癌细胞的生物靶分子。我们发现三氧化二砷显著下调肝癌细胞微小染色体维持蛋白7(Minichromosome maintenance protein 7,MCM7)的表达,这一下调作用在多个肝癌细胞系以及小鼠皮下肿瘤原位注射模型中均得到验证;然而MCM7是否是介导三氧化二砷对肝癌干细胞作用的关键靶分子?我们进一步利用MCM7低表达的肝癌细胞株,重复了上述小鼠肝脏原位荷瘤肺转移实验及部分体外实验,发现MCM7的下调表达可使肝癌肺转移率从64.7%下降至30%,且显著抑制肝癌干细胞在体外的相关表型与功能,证实了MCM7对肝癌转移及肝癌干细胞的重要调控作用。而MCM7在肝癌细胞中的过表达则可抵消三氧化二砷对肝癌干细胞成球的抑制作用,从而明确了MCM7是介导三氧化二砷作用的关键分子。在此基础上,我们还对以上研究结果进行了临床验证,将80例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织进行MCM7的免疫组化染色,发现MCM7在考察的所有患者的肝癌组织中都较癌旁组织呈显著的核内高表达,并且MCM7的表达水平与肝癌进展及预后密切相关。这一结论为解释三氧化二砷的临床治疗效果提供了新的理论依据,对指导三氧化二砷更精准高效的应用也具有重要的意义。最后,为了明确三氧化二砷对MCM7分子的调控机制,我们利用免疫沉淀技术阐明了在肝癌细胞中存在血清反应因子(serum response factor,SRF)/MCM7复合物,以及该复合物通过SRF与MCM7启动子区结合调控MCM7转录的现象;利用有机砷荧光探针与MCM7蛋白芯片反应,确定了三氧化二砷的直接作用靶点为MCM7蛋白;双荧光素酶报告系统进一步阐明三氧化二砷通过抑制SRF/MCM7复合物对MCM7的转录进行调控,从而下调MCM7的表达。综上,我们的研究证实了三氧化二砷通过下调MCM7分子对肝癌转移及肝癌干细胞发挥抑制作用;阐明了三氧化二砷对MCM7的下调是通过与MCM7结合进而抑制SRF/MCM7复合物对MCM7转录调控而实现的。此系列研究结果为三氧化二砷在晚期肝癌的临床应用提供了新的理论支持,为指导其更加安全、科学、精准、高效的使用奠定了基础,同时也为针对MCM7分子及其调控通路的新药筛选提供了重要线索。