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目的：人们对侧支血管生长机制的认识，经过数十年的努力，已经取得了很大的进展，但仍有许多问题需待深入的研究。本实验采用动静脉短路诱导侧支血管生长的模型和平滑肌细胞的体外培养模型，研究了髂外动脉的重塑、侧支血管MCP-1的表达与巨噬细胞浸润之间的关系，从组织水平层面探讨了巨噬细胞对侧支血管生长的作用，以及细胞外基质降解和细胞基质成分对平滑肌细胞粘着斑激酶的表达和增殖的影响。方法1．动物模型的制备24只重3-4kg成年大白兔，戊巴比妥钠进行麻醉（138mM／kg，腹腔注射）暴露股动脉，进行双侧股动脉结扎和单侧股动脉结扎，并将一侧结扎的股动脉远侧端经侧-侧吻合连接到伴行的股静脉上。动物在相应的存活时间点后处死，快速取样，液氮中冷冻，然后用组织媒介剂（OCT复合物）包埋，贮存在-80℃待用。在单侧股动脉结扎的动物未结扎侧者为对照组，在双侧股动脉结扎的动物，未行股动-静脉吻合侧为对照组。2．细胞培养模型原代培养的兔主动脉平滑肌细胞采用酶消化获得。细胞培养液用199培养基和20％的胎牛血清，取第5代或6代的细胞用于实验。对平滑肌粘着斑激酶及增殖的影响采用纤维连接蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）和Matrigel基膜成分三种材料。主要操作步骤是：12孔塑料培养板内放置直径为18毫米的圆形盖玻片，室温下浓度为5ug／cm2 LN或者FN孵育2小时，然后吸出剩余液，并仔细清洗，平滑肌细胞种植到顶层，在37℃和5％CO2的细胞培养箱中进行培养，直到细胞密度达到75％为止。Matrigd基膜基质胶的制备按公司提供的说明书进行。平滑肌细胞种植在胶内，然后加入培养液培养。对于Brdu标记实验，当平滑肌细胞生长密度达到75％左右时，按照公司提供的说明书加入Brdu，细胞培养1小时后进行免疫荧光检测。3．免疫荧光检测组织或培养细胞内蛋白质表达的检测均按常规的免疫荧光程序进行。侧支血管组织检测的蛋白质有RAM11（巨噬细胞的标记物）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），细胞粘附分子（ICAM和VCAM）和Ki67（细胞增殖标记物）：另外部分实验骨骼肌用actin-phalloidin（FITC标记）直接显色，毛细血管用LectinBSl（TITC标记显色）。培养的平滑肌细胞的蛋白质检测包括粘着斑激酶（FAK）和磷酸化的粘着斑激酶（FAKpy397）。上述实验中细胞核的染色根据需要分别采用7-AAD和TOTO3两种细胞核的荧光染料。所有免疫荧光染色切片用Leica共聚焦显微镜拍照。4．定量分析免疫荧光强度的定量测量用LeicaTCS SP共聚焦显微镜上配置的定量测量软件完成，在整个测量过程中灰度值设定在0-255 Pixel强度水平。测量数据用SPSS软件作统计分析。免疫阳性细胞的计数也是在Leica共聚焦显微镜下完成，细胞计数在40X物镜下进行，同时含有被检测蛋白质的阳性产物和细胞核染色的细胞计为阳性细胞。阳性细胞和所有细胞核之比为被检测物质的阳性率，测量结果用SPSS软件作统计分析。5．结果5．1只进行股动脉结扎，没有引起髂外动脉细胞的增殖和ICAM的表达变化，但VCAM在外膜和内膜有少量表达。外膜中含有少量巨噬细胞。在动静脉吻合侧支，髂外动脉的形态结构和蛋白质的表达发生重要变化，细胞增殖率为5％，ICAM的免疫染色在内皮细胞显著上调，VCAM在内皮细胞和外膜均显著上调，外膜中含有大量的巨噬细胞，血管壁中膜有些部位可观察到大量巨噬细胞存在。在动-静脉短路模型中，股动脉结扎远侧端的小腿的中动脉，小动脉和微动脉没有观察到有平滑肌细胞的增殖，而有髂肌变性降解和大量新毛细血管的生成。5．2在正常血管MCP-1表达非常低，而在生长的侧支血管MCP-1的表达显著上调，是正常血管的8倍，MCP-1的上调表达，在血管各层均非常明显。连续切片上MCP-1的表达上调与巨噬细胞浸润呈现一致性。多个时间点的侧支血管巨噬细胞的检测表明：巨噬细胞的浸润在侧支血管的生长过程中呈现出特定的时间模式，在侧支血管生长的早期和活跃期巨噬细胞的浸润十分活跃，在侧支血管生长的成熟期巨噬细胞的浸润显著减少，和正常血管的情况相似。另外在连续切片上观察到有大量巨噬细胞堆积的部位，细胞外基质（弹性纤维染色）的降解明显，并且该部位细胞的增殖活动十分活跃。5．3平滑肌细胞培养实验表明，生长在FN上的平滑肌细胞FAK和磷酸化的FAK的表达最高，细胞增殖也最活跃。生长在LN上的平滑肌细胞FAK和磷酸化的FAK的表达较FN低，细胞增殖率也低，生长在Matrigel基膜基质胶里的平滑肌细胞FAK和磷酸化的FAK的表达最低，没有观察到增殖的平滑肌细胞。小结1．本实验在动静脉短路模型中观察到髂外动脉的重塑以及在小腿处观察到没有侧支血管的生长但有毛细血管发生的事实，为“血流切应力是侧支血管生长驱动力”的观点提供了新的实验依据，同时也进一步证明了缺血只能诱导毛细血管生成而非侧支血管生长。2．在体实验揭示了MCP-1在侧支血管的表达以及巨噬细胞浸润的时间模式以及巨噬细胞与细胞外基质的降解和细胞增殖的密切关系。从组织学和细胞水平上为巨噬细胞对侧支血管的生长作用提供了重要的形态学证据。3．FN对平滑肌细胞FAK的表达和增殖影响较大，三维Matrigel基膜基质胶平滑肌细胞FAK的低表达与没有细胞增殖。这些结果表明细胞外基质成分和基质构筑对平滑肌细胞的增强和移动具有重要的调控作用。