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背景:桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis,HT）,也被称为自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis,AIT）,是临床常见的内分泌系统疾病,其确切发病机制尚未完全明确,目前认为遗传背景和环境因素的交互作用共同导致了疾病的发生发展,而碘是其中最重要的环境因素之一。表观遗传修饰可以通过改变染色质结构、募集转录因子以及调控多种酶等来调节基因转录而不影响DNA碱基序列,是连接环境因素和遗传背景的桥梁。组蛋白甲基化及其相关修饰酶作为表观遗传修饰的重要调节机制与很多自身免疫疾病相关。然而目前尚没有探讨组蛋白甲基化与HT的系统研究。本研究主要从全基因组和整体蛋白水平探讨HT患者甲状腺细胞以及甲状腺组织组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）的变化,同时分析了高碘对甲状腺细胞H3K4me3和组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）的影响及在HT中的可能机制探讨。方法:1)HT患者甲状腺细胞和组织H3K4me3变化:利用免疫共沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation and Deep Sequencing,chip-seq）分析了HT患者和对照组（3HT vs 3Control）原代培养甲状腺细胞全基因组内H3K4me3的分布特征,分析转录起始位点（TSSs）H3K4me3的差异富集位点,KEGG和GO分析相关基因的生物功能和富集通路,RT-PCR验证H3K4me3富集增加的重要基因（8HT vs 8 Control）的转录水平。Western blotting（WB）检测原代培养甲状腺细胞（4HT vs 4 Control）和甲状腺组织（6HT vs 6 Control）H3K4me3的整体蛋白水平,RT-PCR筛选甲状腺组织异常表达的组蛋白甲基化转移酶（30HT vs 30 Control）,免疫组化和Western blotting验证甲状腺组织组蛋白甲基化转移酶MLL1的蛋白表达。2)碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化的影响:分别以10-3M和10-6M碘化钠刺激正常人甲状腺细胞系（N-Thy-ori-3-1）6小时和24小时,免疫共沉淀测序（chip-seq）分析了甲状腺细胞系在不同浓度高碘刺激不同时间后H3K4me3和H3K27me3全基因内的分布特征和差异富集位点,分析转录起始位点H3K4me3或H3K27me3显著差异富集的位点,Real Time PCR（RT-PCR）和Western blotting验证组蛋白去甲基化转移酶JMJD3的表达水平。高碘刺激甲状腺细胞系和HT患者原代培养细胞,RT-PCR筛选可能异常表达的组蛋白甲基化转移酶。梯度浓度高碘刺激甲状腺细胞系6和24小时后,Western blotting分析H3K4me3和H3K27me3整体蛋白水平,免疫荧光分析甲基转移酶的细胞定位,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测高碘刺激下H3K4整体甲基化水平。3)JMJD3抑制剂GSK-J4的体外研究:高碘分别刺激HT患者和对照组甲状腺原代细胞以及正常甲状腺细胞系,PCR检测CCL2,CXCL10的表达;免疫组化和PCR检测HT患者甲状腺组织JMJD3,CCL2,CXCL10的表达。分别以高碘、TNF-α、以及高碘和TNF-α共同刺激甲状腺细胞,RT-PCR检验CCL2,CXCL10的转录表达;甲状腺细胞系在TNF-α作用下,分别加入JMJD3抑制剂GSK-J4和MLL1抑制剂MM102,RT-PCR和Western blotting检验CCL2,CXCL10的表达,Western blot检验细胞H3K27me3整体蛋白水平变化。流式细胞术检测甲状腺细胞氧化应激水平和凋亡。结果:1)HT患者甲状腺细胞和组织H3K4me3变化:chip-seq提示,HT组和对照组的差异peak点平均为1458个,对比到相应的差异基因约为1187个,GO分析显示,差异基因主要参与的生物过程（biological process）包括免疫系统过程（immune system process）,对刺激的反应（response to stimulus）,黏附分子的调节（regulation of cell adhesion）;KEGG分析提示,差异基因主要富集于细胞粘附分子Cell adhesion molecules（CAMs）,自身免疫性甲状腺疾病,（Autoimmune thyroid disease）和癌症通路（Pathways in cancer）等。富集于自身免疫甲状腺疾病通路的在HT组H3K4me3富集增多的差异基因包括:Tg,TSHR,MHCII,CTLA,CD80/86,Fas/Fasl。HT患者甲状腺细胞TG,CCL2,CXCL10,IL8,ICAM1,IL18,ITGA4,FASLG,TRAIL启动子区域H3K4me3富集增加,HT患者TG启动子区域H3K4me3富集丰度使对照组的2.45倍。其中CCL2,IL8,ICAM1的mRNA水平在HT患者甲状腺细胞中增加。HT患者甲状腺组织H3K4me3整体蛋白表达量显著高于对照组,原代培养细胞H3K4me3整体蛋白表达在HT组和Control组无差异。HT患者甲状腺组织MLL1的mRNA和蛋白水平显著升高。2)碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化的影响:梯度浓度高碘刺激正常甲状腺细胞系N-thy-ori3-1 6小时后组蛋白H3K4me3整体蛋白水平随着碘化钠浓度升高逐渐增高,但24小时后趋势下降,呈一过性增高,而H3K4整体甲基化并没有改变。高碘刺激N-thy-ori3-1和原代培养甲状腺细胞均可以引起组蛋白甲基化转移酶MLL1蛋白转录水平升高,免疫荧光发现高碘刺激组和空白对照组MLL1均定位在细胞核。梯度浓度高碘刺激N-thy-ori3-1后发现JMJD3启动子区H3K4me3富集增多,当碘化钠10-3M刺激细胞24小时,JMJD3的mRNA和蛋白水平升高,伴有H3K27me3整体蛋白水平下降。JMJD3在HT患者的甲状腺组织中mRNA和蛋白水平较对照组明显增加。在不同浓度碘化钠刺激下,甲状腺细胞系H3K4me3差异富集的相关基因主要集中于泛素化蛋白水解,细胞连接,cAMP信号通路,赖氨酸降解通路等信号通路,H3K27me3差异富集的相关基因主要集中于细胞连接,钙离子信号通路,谷氨酰胺突触等信号通路。3)JMJD3抑制剂GSK-J4体外研究:高碘作用HT患者甲状腺细胞后发现CCL2表达增加,高碘刺激N-thy-ori3-1和对照组甲状腺细胞CCL2和CXCL10的转录表达没有变化。CCL2,CXCL10在HT患者的甲状腺组织中mRNA和蛋白水平较对照组明显增加。TNF-α作用于N-thy-ori3-1后发现CCL2,CXCL10的mRNA和蛋白水平显著增加,加入GSK-J4后,甲状腺细胞CCL2,CXCL10的转录表达水平和蛋白水平均显著下降,同时甲状腺细胞H3K27me3整体蛋白水平增高。TNF-α作用于N-thy-ori3-1后发现凋亡细胞数和细胞氧化应激水平也明显增加,加入GSK-J4后,甲状腺细胞凋亡和氧化应激也明显下降。结论:1、HT患者甲状腺细胞TG,CCL2,CXCL10,IL8,ICAM1,IL18,ITGA4,FASLG,TRAIL启动子区域H3K4me3富集增加,可能与细胞CCL2,IL8,ICAM1的转录表达增加相关,从表观遗传的角度解释了与HT相关的炎症相关分子表达增高的机制。2、HT患者甲状腺细胞H3K4me3差异富集位点相关基因主要富集于细胞粘附分子Cell adhesion molecules（CAMs）,自身免疫性甲状腺疾病,（Autoimmune thyroid disease）癌症通路（Pathways in cancer）等,提示甲状腺细胞H3K4me3差异改变参与HT的发生发展。3、HT患者甲状腺组织H3K4me3整体蛋白表达水平显著高于对照组,组织中MLL1表达增加可能参与其中。4、高碘能促进甲状腺细胞系N-thy-ori3-1 H3K4me3整体蛋白水平一过性增高,诱导甲状腺细胞系和HT原代细胞高表达MLL1。5、高碘能通过影响JMJD3启动子区H3K4me3富集增多促进JMJD3表达增加,JMJD3在HT患者甲状腺组织中表达增加,提示JMJD3可能成为高碘影响HT的重要因子。6、不同浓度高碘刺激甲状腺细胞对H3K4me3/H3K27me3的调控有极大的相似性,差异富集的相关基因主要集中于细胞连接,蛋白水解,钙离子信号通路。7、高碘可以诱导具有遗传背景或处于炎症环境的甲状腺细胞高表达趋化因子CCL2和CXCL10参与HT的病理过程。8、JMJD3抑制剂GSK-J4能够通过增高H3K27me3水平显著抑制甲状腺细胞CCL2和CXCL10的表达,提示其可能在HT早期有延缓或阻滞炎症细胞浸润的作用。9、GSK-J4能够降低甲状腺细胞氧化应激水平和细胞凋亡,能通过多种机制成为预防或治疗HT的潜在可能。