【摘 要】
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目的本实验构建AKT2基因3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’-UTR)荧光素酶报告基因重组质粒,在培养的体外细胞中验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系,同时构建miR
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目的本实验构建AKT2基因3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’-UTR)荧光素酶报告基因重组质粒,在培养的体外细胞中验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系,同时构建miRNA-625靶序列中的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)rs2304186突变型荧光素酶报告基因重组质粒,验证SNP rs2304186在miRNA-625靶序列调控中的作用。方法通过生物信息学软件TargetSan预测AKT2是miRNA-625的靶基因。PCR扩增AKT2基因3’-UTR,构建AKT2 3’-UTR rs2304186野生型荧光素酶报告基因载体(pMIR-AKT2-WT)、miRNA-625靶位点全突变型质粒(pMIR-AKT2-MUT1)及rs2304186突变型质粒(pMIR-AKT2-MUT2),通过Lipofectamine 2000将重组质粒与miRNA-625 mimics或miRNA NC共转染16HBE细胞株、HEK-293T细胞株及A549细胞株,每个转染组同时加入pRL-SV40作为矫正,双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫(Firefly)荧光素酶和海肾(Renilla)荧光素酶活性。结果构建的重组荧光素酶报告载体经PCR、双酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统结果显示在三种细胞株中pMIR-AKT2-WT+miRNA-625mimics组相对荧光素酶活性比pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics比pMIR-AKT2-MUT1+miRNA-625 mimics组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-625对野生型AKT2 3’-UTR荧光素酶报告基因载体荧光素酶活性有明显的抑制作用,证实miR-625能够靶向调控AKT2基因。同时位于miRNA-625靶序列中的SNP rs2304186 TT型能够降低miRNA-625与靶序列的结合效率。
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