【背景】糖尿病是世界上主要的慢性疾病之一,给人类健康带来了沉重的负担。而糖尿病主要的发病机制之一是胰岛功能障碍,所以有关胰岛的糖尿病研究已成为世界各医学研究院的一个热点问题。目前,研究糖尿病的常规体外实验模式是单层细胞培养,但它不能再现体内的三维组织结构。随着微-纳米技术的发展,利用一些组织工程的方法构建的体外三维胰岛模型可更好地模拟体内胰腺的胰岛。体外三维胰岛模型可比传统的单层细胞培养具有更佳的细胞功能,在生理或病理条件下都能够作为实验平台,更好的观察胰岛行为,在研究糖尿病的分子机制和临床胰岛移植等方面具有潜在的应用前景。近年来,多项研究利用组织工程方法探索构建体外三维胰岛模型,但采用液滴悬挂法构建体外三维胰岛模型并将其与二维单层细胞和原代胰岛进行形态与功能方面对比的研究较少。本课题将利用液滴悬挂法构建体外三维β细胞球微组织作为体外三维胰岛模型,对这一问题进行探讨。【目的】1.采用液滴悬挂法探索构建适宜大小体外三维胰岛微组织。2.从形态和功能两个方面对所构建的体外三维胰岛微组织和二维β细胞进行对比。3.从形态和功能两个方面对所构建的体外三维胰岛微组织和原代胰岛进行对比。【方法】1.制备液滴悬挂板,培养β细胞,根据不同条件,探索制备适宜形态大小的体外三维胰岛微组织的条件,成功制备后,运用细胞活性鉴定试剂盒鉴定其活性。2.采用倒置显微镜和免疫荧光技术观察体外三维胰岛微组织和二维β细胞形态上的异同,采用葡萄糖刺激胰岛素释放实验观察体外三维胰岛微组织和二维β细胞功能上的异同。3.提取大鼠原代胰岛,建立原代胰岛模型,采用倒置显微镜、免疫荧光技术和电镜技术观察体外三维胰岛微组织和原代胰岛形态上的异同,采用葡萄糖刺激胰岛素释放实验观察体外三维胰岛微组织和原代胰岛功能上的异同。【结果】1.采用液滴悬挂法构建适宜形态大小体外三维胰岛微组织的条件是用密度105个/mlβ细胞液滴30μl铺展为直径5 mm的悬滴。2.体外三维胰岛微组织培养7天后,绝大部分细胞活性良好。3.体外三维胰岛微组织与二维β细胞在形态学上相比,体外三维胰岛微组织中β细胞聚集成球形、椭球形或不规则形的立体结构,直径大小约100-200μm,细胞与细胞之间排列紧密;免疫荧光实验显示,体外三维胰岛微组织表达丰富的胰岛素。4.在功能上进行对比,体外三维胰岛微组织胰岛素释放指数(2.08±0.14)高于二维β细胞胰岛素释放指数(1.49±0.21)(P<0.05)。5.体外三维胰岛微组织和原代胰岛在形态学上进行对比,原代胰岛呈球形、椭球形或不规则形立体结构,直径大小约100-200μm,细胞与细胞之间排列紧密,原代胰岛外表面光滑,有一层膜包裹;体外三维胰岛微组织形态大小和原代胰岛类似,但没有包膜包裹,细胞裸露在表面。免疫荧光实验显示,体外三维胰岛微组织的β细胞分布和胰岛素的表达量与原代胰岛类似。6.在功能上进行对比,三维胰岛微组织胰岛素释放指数(2.08±0.14)低于原代胰岛胰岛素释放指数(2.72±0.31)(P<0.05)。【结论】1.通过探索实验条件,采用液滴悬挂法可以构建适宜形态大小且活性良好的体外三维胰岛微组织。2.体外三维胰岛微组织与二维β细胞在形态学上相比,体外三维胰岛微组织为立体结构;功能上相比,体外三维胰岛微组织的胰岛素分泌功能优于二维β细胞。3.体外三维胰岛微组织与原代胰岛在形态学上相比,体外三维胰岛微组织与原代胰岛类似;功能上相比,体外三维胰岛微组织胰岛素分泌功能尚不及原代胰岛。