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炎性反应是天然免疫最主要的应答结果,也是机体抵抗病原菌侵染以及应对组织损伤的重要手段。炎性反应的触发主要由NF-κB通路、MAPK通路和JAK-STAT通路等信号通路介导。沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,沙门菌的感染可诱导机体产生强烈的炎性反应。NF-κB通路介导的炎性反应在沙门菌与宿主相互作用中发挥重要作用。当沙门菌侵染机体时,机体可以通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别细菌的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)进而发现入侵的细菌。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类重要的模式识别受体,其可通过识别细菌的脂蛋白(TLR2配体)、脂多糖(TLR4配体)、鞭毛蛋白(TLR5配体)、未甲基化的CpG DNA(TLR9配体)等活化NF-κB通路,从而诱导炎性应答的产生。其中鞭毛蛋白是一种重要的炎性诱导分子,其被细胞表面的TLR5识别后通过信号传导激活IKK激酶(包括IKKα、IKKβ和IKKγ亚基),激活的IKK可使NF-κB抑制蛋白κB磷酸化,进而导致核转录因子NF-κB的活化,并最终诱导炎性因子的产生,抵抗病原菌的侵染。炎性应答的发生也是一把双刃剑,虽然NF-κB介导的炎性反应可以抵抗病原菌的侵染,但是过度或失调的炎性反应可以引起机体的组织损伤,并引发炎性疾病。例如炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)就是由于炎性反应的过度产生而导致的慢性炎性肠病,严重危害着人类的健康。在IBD患者的结肠组织中可以检测到NF-κB的过度活化,NF-κB介导的炎性应答被认为在IBD的致病过程中发挥着重要的作用。因此机体炎性应答的产生应该受到严格而精密的调控。MicroRNA(miRNA)是一类新近发现的具有转录后水平调控作用的非编码RNA,广泛存在于真核生物中,通过靶向结合mRNA的3’端非翻译区(3’ untranslated region,3’ UTR)促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控基因的表达。miRNA可参与多种生物学的调节过程,包括生长、发育、免疫应答等。近年来的研究发现miRNA在宿主的炎性应答中发挥着重要的调节作用。虽然已有关于miRNA参与调节炎性应答的报道,但是多数miRNA的功能仍然未知,尤其是关于miRNA在鞭毛蛋白诱导TLR5/NF-κB炎性通路中的调节作用少有报道。本实验室的前期研究发现mmu-microRNA-5112(miR-5112)在鞭毛蛋白活化小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的过程中表达水平下调,并初步发现其可通过靶向IKKγ参与鞭毛蛋白在TLR5/NF-κB通路中诱导炎性应答的调控。本研究进一步测定了 miR-5112的表达规律,分别通过体内体外实验分析了 miR-5112在鞭毛蛋白诱导炎性应答中的功能和机制;利用外源性agomiR-5112通过体内外实验探究了 miR-5112对沙门菌诱导炎性反应的调节作用;同时通过小鼠模型测定了 miR-5112对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的炎症性肠病的调节作用。1.miR-5112调节鞭毛蛋白诱导的炎性应答的研究通过体内外实验检测鞭毛蛋白活化脾脏DCs后miR-5112的表达情况。以100 ng/mL鞭毛蛋白刺激磁分选获得的脾脏DCs,ELISA检测细胞上清中炎性因子的表达,结果显示鞭毛蛋白可以在体外诱导脾脏DCs分泌IL-6和IL-12 p40;qRT-PCR检测miR-5112表达水平的结果显示鞭毛蛋白体外刺激脾脏DCs后miR-5112的表达水平明显下调。以2 μg剂量的鞭毛蛋白腹腔免疫C3H/HeJ小鼠,磁分选获得脾脏DCs,qRT-PCR检测其炎性因子和miR-5112的表达水平,结果显示鞭毛蛋白免疫组小鼠脾脏DCs中炎性因子IL-6的表达水平上调,而miR-5112表达水平发生下调。以上结果表明鞭毛蛋白可以在体内外诱导下调脾脏DCs中miR-5112的表达。qRT-PCR检测鞭毛蛋白刺激C3H/HeJ小鼠来源BMDCs后miR-5112表达的时间动态变化规律。结果显示鞭毛蛋白刺激BMDCs后miR-5112的表达水平先下调,然后又可恢复至正常水平。不同 TLR 配体 Pam2CSK4(TLR2 配体)、Poly(I:C)(TLR3 配体)、LPS(TLR4配体)、FliC(TLR5 配体)、R848(TLR7 配体)、CpG-ODNs(TLR9 配体)作用于 C57BL/6小鼠源的BMDCs,qRT-PCR检测miR-5112的表达情况。结果显示,除CpG-ODNs以外,其它5种TLR配体均可诱导BMDCs中miR-5112的表达水平下调1.5倍以上。qRT-PCR测定miR-5112在小鼠各脏器组织中的分布表达规律,结果显示小鼠各脏器和组织中均能检测到miR-5112的表达,但在不同脏器和组织中miR-5112的表达分布存在较大差异。以上结果表明miR-5112的表达具有一定的时间性和组织差异性,这可能与其发挥功能是相互适应的。分别以不同的鞭毛蛋白突变体刺激小鼠BMDCs,结果显示89-96aa(TLR5识别位点)和460-494aa(NLRC4识别位点)缺失的鞭毛蛋白均不能诱导miR-5112表达水平的下调,只有同时具有TLR5和NLRC4活性的鞭毛蛋白才可诱导miR-5112表达水平的下调,表明TLR5信号通路和NLRC4信号通路对于miR-5112的下调表达是必需的。此外,野生型鞭毛蛋白刺激MyD88基因缺失小鼠来源的BMDCs,并不能诱导其miR-5112表达水平发生变化,这进一步表明miR-5112的下调需要TLR5和NLRC4信号通路的参与。miR-5112 mimics转染BMDCs后,检测miR-5112对鞭毛蛋白诱导炎性因子表达水平的影响。结果显示,转染miR-5112mimics的BMDCs经鞭毛蛋白刺激后,炎性因子IL-12 p40的表达水平明显降低,表明miR-5112可以抑制鞭毛蛋白诱导的炎性应答。Western Blotting检测BMDCs中炎性信号分子的表达,结果显示miR-5112 mimics可以显著抑制其靶标分子IKKγ的表达,同时miR-5112 mimics转染组中NF-κB P65的磷酸化水平也明显下调,表明miR-5112可以通过调节IKKγ的表达抑制NF-κB通路炎性因子的表达。利用agomiR-5112(模拟物)和antagomiR-5112(抑制物)评价miR-5112在小鼠体内对鞭毛蛋白诱导炎性应答的调节作用。agomiR-5112和antagomiR-5112腹腔注射小鼠24 h后,分别腹腔免疫鞭毛蛋白,然后利用ELISA和CBA检测小鼠血清中炎性因子的变化。结果显示agomiR-5112可以明显减少鞭毛蛋白诱导小鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-10含量的增加;而antagomiR-5112则可增加鞭毛蛋白诱导的炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-10的含量;表明miR-5112可以在小鼠体内调节鞭毛蛋白诱导的炎性应答。2.miR-5112调控沙门菌诱导的炎性应答的研究利用小鼠腹腔巨噬细胞建立肠炎沙门菌感染的体外模型,评价miR-5112对沙门菌诱导的炎性应答的调节作用。结果显示,agomiR-5112转染小鼠腹腔巨噬细胞后可明显增加细胞中miR-5112的含量。agomiR-5112转染组腹腔巨噬细胞经沙门菌感染后,其炎性因子IL-6的分泌水平显著低于单独的沙门菌感染组,表明miR-5112可以体外调节沙门菌诱导的炎性应答。利用链霉素预处理的小鼠建立沙门菌感染的体内模型,评价miR-5112在体内对沙门菌诱导的炎性应答的调节作用。Luminex检测沙门菌感染后小鼠血清中细胞因子的变化,沙门菌感染小鼠8h时,在各感染组的小鼠血清中均未能检测到明显的细胞因子变化,表明肠炎沙门菌感染早期不能诱导小鼠血清中细胞因子含量的增加。沙门菌感染4d时,在各沙门菌感染组的小鼠血清中均可以检测到明显的细胞因子变化,且腹腔注射agomiR-5112可以明显降低血清中沙门菌诱导的细胞因子的增加,包括IL-lβ、IL-12p40、IL-6、TNF-α和IP-10。病理分析结果显示,肠炎沙门菌感染8 h和4 d时,小鼠肝脏和盲肠组织中均有炎性细胞浸润现象,但是注射agomiR-5112后的沙门菌感染组小鼠脏器的炎性细胞聚集现象明显减少,表现出轻微炎症,病理损伤较小。以上结果表明了 miR-5112可以在体内抑制沙门菌诱导的炎性反应。沙门菌感染后各脏器的定植结果显示,在沙门菌感染8h时,agomiR-5112注射组小鼠的肠道组织(结肠、回肠和盲肠)中沙门菌的定植数明显少于单独的沙门菌感染组,表明miR-5112可以抑制沙门菌在小鼠体内的定植。小鼠的体重监测结果显示,agomiR-5112可以明显减少沙门菌诱导的小鼠体重降低程度,同时小鼠的存活曲线显示注射agomiR-5112后的沙门菌感染组小鼠的存活时间长于单独的肠炎沙门菌感染组,表明agomiR-5112可以一定程度的延缓沙门菌诱导的死亡。以上结果表明miR-5112可作为重要的调节因子参与宿主的炎性应答与抗菌感染。3.miR-5112调节DSS诱导的结肠炎的研究建立DSS诱导的小鼠结肠炎模型,使用外源性agomiR-5112评价miR-5112对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。小鼠自由饮用4%DSS后出现了食欲减退、精神萎靡、形体消瘦、活动减少、皮毛凌乱无光泽等症状,随着时间的推移小鼠开始出现稀水样粪便和便血情况,表现出典型的结肠炎症状,表明成功地建立了小鼠的结肠炎模型。小鼠自由饮用DSS后第3 d和第6 d血清中炎性因子检测结果显示,小鼠饮用DSS后血清中炎性因子IL-6的含量增加,且agomiR-5112可以明显抑制DSS诱导的血清中炎性因子IL-6含量的增加,表明miR-5112可以降低DSS诱导的系统性炎症。饮用DSS 6 d后,利用ELISA测定结肠组织中炎性因子的变化,结果显示,小鼠结肠组织中的炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1的表达量增加,且注射agomiR-5112可以抑制结肠组织中IL-6、TNF-α和MCP-1的增加。MPO是中性粒细胞特征性酶,可作为炎性反应的标志,结肠组织中MPO的测定结果显示注射agomiR-5112可以抑制DSS诱导的MPO含量的增加。结肠组织的病理分析结果显示,与单独的DSS处理组小鼠相比,注射agomiR-5112可以明显减少结肠组织中炎性细胞浸润、减轻对结肠组织结构的破坏程度。结肠组织的长度缩短是反映DSS诱导结肠炎炎性强弱的一个重要指标,其测定结果显示agomiR-5112可减少DSS诱导的结肠长度的缩短。以上结果均表明agomiR-5112可以抑制DSS诱导的结肠炎小鼠的炎症反应。疾病活动指数DAI的评分结果显示,小鼠自由饮用DSS后,随着时间的推移,DAI评分显著升高,表明小鼠结肠炎的临床病症逐渐加重;腹腔注射agomiR-5112可以明显降低小鼠结肠炎的DAI评分,表明agomiR-5112可以减缓结肠炎发展的临床表征。以上研究结果表明miR-5112可以参与调节DSS诱导的结肠炎,抑制DSS诱导的炎性反应,减缓DSS诱导的结肠炎的临床病症。该结果也暗示着miR-5112具有成为治疗炎症性肠病靶点和药物的潜力。