高效液相色谱荧光法测定血清犬尿喹啉酸和色氨酸及其临床应用

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目的:1.建立一种简单、灵敏的高效液相色谱—荧光检测法(HPLC—FLD)同时测定血清中的犬尿喹啉酸(KYNA)和色氨酸(TRP)含量。2.用该方法测定健康国人血清KYNA含量和KA/T比值(KYNA/TRP),建立参考值范围。3.初步探讨血清KYNA和TRP含量在精神分裂症(Sch)中的临床意义。方法:1.血清标本用等量5%(V/V)高氯酸溶液去除蛋白后取上清液20μl进样分析。用Hypersil C8色谱柱(300mm×6.0mm i.d.,10μm)分离;流动相为0.5mol/L醋酸锌及50mmol/L醋酸钠溶液(含6%乙腈);流速1.5ml/min;荧光检测波长:激发光波长404nm,发射光波长0-9.5min为344nm,9.5min后254nm;室温下测定;14分钟内完成分析测定。KYNA和TRP峰采用峰保留值比较法和叠加法定性分析,用外标法测峰面积进行定量分析。同时探讨了检测波长、流动相种类、流动相中有机相的比例以及蛋白沉淀剂等因素对分离度和灵敏度的影响,考察了其它5种氨基酸、多巴胺类物质对待测组分的可能干扰。2.测定健康体检者(n=108例)血清KYNA和TRP含量,并计算KA/T比值,以95%可信限界定相应参数的范围。3.根据用药情况,将Sch患者分为三组,检测各组KYNA和TRP含量,探讨KYNA、TRP含量及KA/T的变化在Sch中的意义。结果:1.血清标本内的KYNA和TRP均达到基线分离,保留时间分别为8.1min、11.3min左右。KYNA线性范围为1.05~2093nmol/L,最低检出浓度为0.05nmol/L,平均回收率为101.19%,日内CV为3.20%,日间为4.27%。TRP线性范围为0.49~196μmol/L,最低检出浓度为0.001μmol/L,平均回收率为104.43%,日内CV为3.31%,日间为4.14%。其它氨基酸如苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、犬尿氨酸(KYN)和一些含有苯环结构的生物活性物质如5-羟色胺(5-HT),肌酐(Cr)在本文的色谱条件下对KYNA和TRP的测定均无干扰。2.108例健康国人血清KYNA浓度为11.85~45.32nmol/L((?)±s=23.30±8.31nmol/L),TRP浓度为27.15~68.03μmol/L((?)±s=47.59±10.43μmol/L),KA/T比值为0.22~1.03×10-3((?)±s=(0.51±0.20)×10-3)。血清TRP含量与年龄及KYNA含量成正相关关系(rs=0.247,P=0.010;rs=0.192,P=0.046),KA/T比值与年龄成正相关关系(rs=0.333,P=0.000);性别之间,血清TRP含量差异有统计学意义(P<0.05),KYNA含量及KA/T比值均无统计学意义(P>0.05)。3.与正常组比较,Sch初始发病未用药组患者血清KYNA和TRP含量均升高;停药复发组KYNA和TRP无变化;坚持用药组KA/T比值下降。结论:1.首次在国内建立了同时测定血清中KYNA和TRP浓度的HPLC-FLD法,该法具有灵敏度高,准确性好,重复性佳,抗干扰能力强,简便快速等特点。2.首次测定了108例健康中国人血清KYNA含量,并确定了其95%参考值范围(11.85~45.32nmol/L)。3.初步探讨了血清KYNA、TRP和KA/T比值在Sch中的意义。与正常组比较,初始发病未用药组Sch血清KYNA和TRP含量均升高;停药复发组KYNA和TRP无明显变化;一直用药组KA/T比值下降。坚持抗精神药物治疗可能降低KYNA和TRP含量。
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