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植物SHN1转录因子具有调控下游蜡质基因表达,控制植物表皮蜡质合成的功能。LACS家族基因编码脂酰辅酶A合成酶（long-chain acyl-Co A synthetase）,能够调控蜡质成分中脂肪酸的合成与代谢。拟南芥At SHN1转录因子可以直接结合在At LACS2基因启动子上,调控其表达。为研究脐橙Cs SHN1转录因子调控下游蜡质基因表达的分子机理,本研究首先利用酵母单杂交技术验证Cs SHN1转录因子的转录激活活性。然后,从“纽荷尔脐橙”中克隆出可能与Cs SHN1转录因子结合的下游蜡质基因CsLACS2的启动子序列,并进行顺式作用元件分析。再根据顺式元件分析情况,设计并获得CsLACS2的启动子缺失片段。最后,使用酵母单杂交技术筛选能与Cs SHN1结合的CsLACS2基因的最短核心片段,并推测核心元件。同时,根据课题组之前已克隆的Cs SHN1基因启动子全长序列,设计并获得Cs SHN1基因启动子缺失片段,构建Cs SHN1基因启动子缺失片段活性检测表达载体,导入根癌农杆菌,并遗传转化拟南芥,为获得Cs SHN1启动子核心片段和核心元件奠定基础。主要研究成果如下:1.Cs SHN1转录因子转录激活活性验证:在SD-Leu/-Trp/-His平板上出现了正常生长的酵母菌落,表明了Cs SHN1-p GBKT7载体上的DNA结合域可以与酵母细胞GAL4上游活化序列UAS结合,引起了下游报告基因的转录,证明Cs SHN1具有转录激活活性。2.CsLACS2启动子及5’缺失片段克隆:我们克隆出来2000 bp的CsLACS2启动子序列。生物信息学分析表明,CsLACS2启动子序列上含有多个非生物胁迫和生物胁迫响应顺式作用元件,激素响应相关顺式作用元件和光响应元件,说明CsLACS2可能是一个非生物胁迫和生物胁迫响应基因。根据CsLACS2启动子上顺式作用元件分布,我们克隆获得了4个CsLACS2启动子5’缺失片段,分别为CsLACS2-pro1（1368bp）、CsLACS2-pro2（967 bp）、CsLACS2-pro3（649 bp）和CsLACS2-pro4（301 bp）。3.Cs SHN1转录因子与CsLACS2启动子结合鉴定:在SD/-Leu/+150 ng/m L Ab A平板上,阳性对照平板菌落生长正常,阴性对照没有出现酵母菌斑,CsLACS2平板上出现了几个酵母菌落。研究证明Cs SHN1转录因子可以与CsLACS2启动子结合。4.Cs SHN1转录因子与CsLACS2缺失片段结合鉴定:结果显示CsLACS2-pro1（1368 bp）、CsLACS2-pro2（967 bp）、CsLACS2-pro3（649 bp）都有酵母菌落生长,而CsLACS2-pro4（301 bp）无菌落生长,表明Cs SHN1转录因子在CsLACS2启动上的结合位点位于CsLACS2-pro3和CsLACS2-pro4之间。因此,我们推测Cs SHN1转录因子与CsLACS2启动子的结合位点可能是位于-649 bp～-301 bp之间的TC-rich repeats、AAGAA-motif等顺式作用元件。5.Cs SHN1启动子核心片段筛选结果:利用5’缺失法将启动子分为了6段:Cs SHN1-pro1（100 bp）、Cs SHN1-pro2（376 bp）、Cs SHN1-pro3（476 bp）、Cs SHN1-pro4（764 bp）、Cs SHN1-pro5（1062 bp）、Cs SHN1-pro6（1310 bp）,分别克隆后导入p BI121表达载体,成功构建Cs SHN1启动子缺失片段活性检测重组表达载体,利用冻融法将这些载体导入根癌农杆菌中,并遗传转化模式植物拟南芥。