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小麦蓝矮病（wheat blue dwarf disease,WBD）是我国西北地区冬小麦上的一种植原体病害,常造成严重的损失。三十年来,科学家对小麦蓝矮病开展了一系列的研究,包括病原的鉴定及分类、介体昆虫传播特性、寄主范围的确定、抗病品种的鉴定等,并取得了一系列的成果。但是由于植原体不能在体外培养,因此缺少进一步的研究方法。随着测序技术的发展,植原体基因组测序已经成为植原体研究的一个新的手段。因此对WBD植原体进行基因组序列测定,并研究WBD植原体编码的蛋白的功能,将在一定程度上揭示WBD植原体与寄主（植物和昆虫）互作的分子机理。本文以感染WBD植原体的长春花为材料,开展了WBD植原体质粒的克隆与拷贝数分析,WBD植原体染色体DNA的分离与富集,WBD植原体基因组序列的测定与生物信息学分析以及WBD植原体分泌蛋白功能的研究。主要研究结果如下:1.2011年于陕西韩城合阳采集疑似小麦蓝矮病株194株,抽提样品总DNA,对WBD植原体和小麦矮缩病毒（wheat dwarf virus,WDV）进行检测。巢式PCR的结果和扩增片段的序列说明采集的病株中有10株感染WBD植原体。WDV特异引物的PCR结果显示91.6%的样品感染WDV,而且感染WBD植原体的小麦植株中均含有WDV。之后通过条沙叶蝉,将WBD植原体从感染WBD植原体的小麦植株传播到健康的长春花上。长春花发病后,WBD植原体通过嫁接的方式在长春花中保存和扩繁。长春花感染WBD植原体之后表现花绿变、花变叶、叶芽萌发和叶片黄化等症状。PCR和测序结果证实这些长春花感染WBD植原体,通过植原体分类工具i Phy Classifier分析发现本实验得到的WBD植原体为16SⅠB亚组植原体。2.根据目前已经公布的植原体质粒序列设计特异性引物,从感染WBD植原体的长春花总DNA中克隆到3个WBD植原体的质粒,p WBD1、p WBD2和p WBD3,并通过Southern杂交证实了这3个质粒的存在。WBD植原体的3个质粒分别长3449 bp、3844 bp和3601 bp,编码15个蛋白,包括Rep、Cop和SSB蛋白,其中有5个为膜蛋白,5个为分泌蛋白。基于来源于植原体和双生病毒的Rep蛋白氨基酸序列的系统进化分析表明p WBD1和p WBD2与p Pa WBNy-1的亲缘关系最近,而p WBD3与p Pa WBNy-2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明WBD植原体的3个质粒具有组织特异性,在不同侵染时期的长春花叶片中的数量也不一致。总的来说,WBD植原体质粒拷贝数在接穗以下的组织中较高,在根中最高。p WBD1的拷贝数在整个侵染时期变化不大,p WBD2和p WBD3在显症3个月后的拷贝数最高。3.以感染WBD植原体的长春花为材料,通过差速离心和脉冲电泳,成功的分离到一条大小约为650 kb的DNA条带,经PCR和Southern杂交确认其为WBD植原体染色体DNA。采用透析袋电洗脱的方法回收该条带的DNA,并通过超滤管进行浓缩,之后以浓缩的样品为模板采用全基因组扩增技术对样品进行扩增,并通过实时荧光定量对全基因组扩增后的产物和提取过程中各阶段的样品进行分析,结果表明差速离心、脉冲电泳和基因组扩增可以逐步提高WBD植原体染色体DNA的纯度,最终可以提高1418.4倍。同时经过此流程我们获得了37微克,纯度为92.9%的WBD植原体染色体DNA样品。4.以全基因组扩增产物为模板,构建了两个大小不同的基因组测序文库,并对这两个基因组测序文库进行高通量测序,获得约11 Gb的原始数据。首先运用CLC Genomic workbench对这些数据进行de novo拼接,然后使用SSPACE-BASIC v2.0进一步拼接,之后使用TBLASTN工具和PCR技术对拼接得到的序列进行筛选,最后采用PCR对筛选的contigs进行拼接,最终获得了WBD植原体的基因组草图。WBD植原体基因组草图由6条contig组成,总大小为611,462 bp,大约覆盖WBD植原体染色体DNA的94%的区域。经过注释发现WBD植原体基因组编码2个r RNA基因操纵子,32个t RNA和525个蛋白。在编码的525个蛋白中,269个蛋白可以划分到17个COG功能类型。与其他植原体基因组的比较基因组分析发现,WBD、OY-M和AY-WB基因组之间存在着广泛的重组和颠换。WBD植原体中大多数编码蛋白的基因与其他植原体的基因同源,只有22个基因为WBD植原体所特有。KEGG通路分析表明与其他植原体一样,WBD植原体代谢能力十分差。但是WBD植原体中存在46个转运子,这些转运子参与了蔗糖、二肽/寡肽、亚精胺/腐胺、钴离子、钠离子、锰离子和锌离子的转运。WBD植原体还编码Sec分泌系统,可以将部分蛋白分泌到寄主细胞中。经预测,WBD植原体染色体DNA和质粒共编码37个分泌蛋白。这些蛋白中有与目前公布的3个植原体致病因子（TENGU、SAP11和SAP54）相似的蛋白。除此之外,WBD植原体还编码一些可能帮助WBD植原体适应不同环境的蛋白。5.克隆了WBD植原体的37个分泌蛋白基因,并成功的将其构建到植物病毒表达载体p GR107中。运用农杆菌介导的植物病毒载体在本氏烟中表达这些分泌蛋白,发现一个分泌蛋白SWP1能够导致植物的增殖。SWP1由WBD0004基因编码。氨基酸序列分析发现SWP1与SAP11一致性为42.22%,但关键功能区域（核定位信号和下游靶标结合区域）的序列差异较大。尽管SWP1序列C端含有一个单分型的核定位信号序列,但对SWP1及突变体的亚细胞定位和功能研究表明SWP1的核定位信号不发挥核定位的功能,也不是SWP1诱导增殖所必须的。采用实时荧光定量PCR分析WBD0004在不同时期和组织中的表达量,WBD0004在长春花花中的表达量最高,叶片中WBD0004表达量在嫁接90天时含量最高。6.运用农杆菌介导的植物病毒载体在本氏烟中表达这些分泌蛋白,还发现一个能够诱导本氏烟过敏性坏死反应的分泌蛋白SWP11。SWP11由WBD0236基因编码。SWP11与SGFP在本氏烟16c中共表达发现该蛋白并不是基因沉默抑制子。组织化学染色结果表明SWP11能够诱导本氏烟H2O2的产生及胼胝质的积累。实时荧光定量PCR分析结果证实SWP1能够诱导坏死相关marker基因和防御相关基因表达量的上调。烟草亚细胞定位表明,SWP11与定位于胞间连丝的TMV运动蛋白有着相似的定位情况。SWP11功能域分析表明SWP11的N端能够诱导植物的过敏性坏死反应,是SWP11发挥其激发子功能必须的。实时荧光定量PCR分析WBD0236在转录水平上的表达量,根中WBD0236的表达量为所有组织中最高,叶片中WBD0236在嫁接40天时表达量最高。7.WBD植原体也编码一些能够抑制SWP11和其他激发子（BAX,INF1）诱导的植物细胞程序性死亡的分泌蛋白。SWP6、SWP12、SWP21和SWP31能够抑制SWP11和BAX诱导的细胞程序性死亡,SWP6和SWP31能够抑制INF1诱导的细胞程序性死亡。