背景和目的勃起功能障碍（erectile dysfunction, ED）是中老年男性的常见病、多发病。ED的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,明确糖尿病性ED的发病机理、寻找有效的治疗措施、发展个体化治疗具有重要的意义。在阴茎勃起过程中,阴茎海绵体平滑肌（corpus cavernosum smooth muscle, CCSM）为各种因素作用的终末组织,处于重要的核心地位。平滑肌细胞分为收缩型和增殖型两种类型,收缩型的主要功能是收缩和舒张,维持组织器官的正常形态结构和功能,而增殖型主要在细胞增生、迁移、分泌及降解胞外蛋白等方面发挥作用,平滑肌细胞能根据细胞的局部环境变化重塑其表型,具有双向分化功能。阴茎海绵体组织被认为是一种特殊的血管组织,其小梁中的平滑肌细胞与心血管系统平滑肌细胞在功能上具有相似性。但是它们做功时,心血管系统平滑肌表现为主动收缩过程,迫使血液流动,而阴茎勃起要求海绵体平滑肌主动舒张,以利于动脉血流入,血窦充盈。CCSM细胞是否同样具有表型转化的特性,相关研究报道较少。本课题组近年来通过对糖尿病性、高血压性ED大鼠模型研究发现,糖尿病和高血压会引起大鼠CCSM细胞发生表型转化,即收缩型转化为增殖型,而且,这种发生在CCSM细胞的表型转化与ED的发生发展有关。myocardin属于SAP （SAF-A/B, Acinus, PIAS）核蛋白超家族成员,myocardin是平滑肌细胞表型调控过程中重要的调控因子,有研究证实myocardin是平滑肌细胞保持收缩型表型的必须因子,平滑肌细胞收缩表型的维持有赖于myocardin的功能激活。在非洲蟾赊胚胎中,使用myocardin负性显性突变体与野生型myocardin蛋白竞争结合血清反应因子（serum response factor, SRF）,结果导致心脏相关基因表达缺失。通过腺病毒介导的人类myocardin基因转染,可以剂量依赖性的提高正常血管平滑肌细胞myocardin mRNA的表达,同时,也可以明显提高收缩相关蛋白,如平滑肌细胞α肌动蛋白（SMa-actin, SMA）,平滑肌细胞肌球蛋白重链（smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC）,碱性调宁蛋白（calponin）的表达。尽管myocardin基因调控血管平滑肌细胞表型的作用已经明确,但是,myocardin基因对糖尿病性大鼠CCSM细胞表型转化的调控作用未见报道。因此,本研究应运基因转染的方法,把外源myocardin基因导入糖尿病性大鼠阴茎海绵体内,观察myocardin （?）基因对大鼠CCSM细胞表型及对大鼠阴茎勃起功能的影响,试图为糖尿病性ED大鼠的个体化治疗提供新靶标和新方法。方法1.糖尿病性ED大鼠CCSM细胞表型特征使用qRT-PCR检测糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体组织中SMA,SMMHC,肌滑蛋白（smoothelin）及calponin mRNA的表达。使用western blot检测阴茎海绵体组织和原代培养CCSM细胞中SMA,SMMHC的蛋白表达水平。使用I型胶原格栅细胞收缩力测定法检测CCSM细胞收缩力。初步明确糖尿病性大鼠CCSM细胞表型与ED的相关性。2. myocardin和SRF在糖尿病性大鼠阴茎海绵体组织中的表达及意义使用qRT-PCR和western blot检测myocardin和SRF在糖尿病性大鼠和正常对照大鼠阴茎海绵体组织中的表达。初步探讨myocardin和SRF在大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型调控中的作用。3. myocardin基因治疗对糖尿病性大鼠阴茎勃起功能及其CCSM细胞表型的影响通过重组腺病毒载体携带nyocardin基因,导入糖尿病性大鼠阴茎海绵体内,5-7天后,使用海绵体神经刺激下阴茎海绵体压力测定评价勃起功能,同时测量颈动脉压力,计算其比率。测压后,取大鼠血清测雄激素水平,取大鼠阴茎组织,使用qRT-PCR测量组织中myocardin,平滑肌细胞表型标记物SMA、SMMHC及calponin,勃起相关因子nNOS （nitric oxide synthase）、eNOS及cGMP （cyclic guanosine monophosphate） mRNA表达。使用Masson染色法观察大鼠CCSM含量的变化。探讨myocardin基因治疗改善糖尿病性大鼠阴茎勃起功能的机制。结果1.糖尿病（diabetes mellitus, DM）性ED大鼠CCSM细胞表型特征通过qRT-PCR检测阴茎海绵体组织中收缩相关基因mRNA的表达,结果发现：与正常对照组及DM组大鼠比较,SMA、calponin、SMMHC及smoothelin在DM&ED组大鼠表达显著下降（P=0.001和0.020,P=0.014和0.012,P<0.001和P<0.001,P=0.005和<0.001）。与正常对照组大鼠比较,SMA、calponin、SMMHC及smoothelin在DM组大鼠阴茎海绵体组织中的表达减少,但两者间差异无统计学意义（均为P>0.05）。通过免疫印迹检测了SMA和SMMHC的蛋白水平表达,结果证实SMA和SMMHC在DM&ED组大鼠阴茎海绵体组织中表达下降（均为P<0.001）。在实验中,通过形态学观察,发现三组来源的细胞无形态上的差别,均表现为梭形,呈谷-峰样生长。我们发现在培养过程中,随着传代的增加,CCSM细胞SMA和SMMHC表达逐渐减少。之后,我们选择相对稳定的第2代细胞进行比较,发现SMA和SMMHC在DM&ED组显著减少（均为P<0.001）。为了证实CCSM细胞收缩功能是否会受收缩相关基因下降影响,我们进行了格栅细胞收缩力测定,结果提示：在血清及钙离子运载体Calcium-Ionophore作用下DM&ED组CCSM细胞收缩力下降（均为P0.001）。2. myocardin和SRF在糖尿病性大鼠CCSM组织中的表达及意义与正常对照组大鼠（23.226±9.712）比较,myocardin mRNA在糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中（4.931±3.987）的表达显著减少（P<0.001）。与正常对照组大鼠（19.054±5.236）比较,SRFmRNA在糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中（7.524±4.767）的表达也显著减少（P<0.001）。和：mRNA水平表达相一致,与正常对照组大鼠比较,myocardin和SRF蛋白在糖尿病大鼠阴茎海绵体组织表达下降（P<0.001）。myocardin（r=0.551,P<0.001）和SRF（r=0.689,P<0.001）在：mRNA水平的表达与蛋白水平表达呈正相关关系。3. myocardin基因治疗对糖尿病性大鼠阴茎勃起功能及其CCSM细胞表型的影响myocardin基因导入大鼠阴茎海绵体5-7天后,通过阴茎海绵体压力测定及颈动脉测压,计算最大阴茎海绵体刺激压/颈动脉压比率（intracavernous pressure/mean arterial pressure, ICP/MAP）比率。结果显示：MAP在myocardin基因治疗的糖尿病性大鼠（A组）、导入空载体组（B组）、仅注射培养液组（C组）、假手术组（D组）及正常对照组（E组）间总体比较差异没有统计学意义（F=0.721,P=0.587）；ICP在各组间总体比较差异有统计学意义（F=37.672,P<0.001）,组间两两比较,A组分别与B组、C组、D组比较,差异有统计学意义（均为P<0.001）,A组与E组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）；ICP/MAP在各组间总体比较差异有统计学意义（F=10.648,P<0.001）,组间两两比较,A组分别与B组、C组、D组比较,差异有统计学意义（P值分别是0.033,0.004,0.007）,A组与E组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。通过qRT-PCR对大鼠阴茎海绵体组织myocardin mRNA检测发现,A组、B组、C组、D组及E组间总体比较差异有统计学意义（F=14.017,P<0.001）。A组]myocardin mRNA表达量显著高于其他组别。qRT-PCR检测发现SMA（F=17.177,P<0.001）、SMMHC（F=8.459,P<0.001）及calponin（F=29.938,P<0.001）在A组、B组、C组、D组和E组间总体比较差异有统计学意义。SMA、SMMHC及calponin在A组及E组的表达显著高于B组、C组和D组。A组与E组比较,SMA、SMMHC及calponin表达差异没有统计学意义。qRT-PCR检测发现eNOS（F=7.500,P<0.001）、nNOS（F=25.923,P<0.001）及cGMP（F=39.666,P<0.001）在A组、B组、C组、D组和E组间总体比较差异有统计学意义。eNOS、nNOS及cGMP在E组的表达显著高于A组、B组、C组和D组。A组、B组、C组和D组间比较差异没有统计学意义。采用Elisa方法检测大鼠血清睾酮水平显示,睾酮水平在A组、B组、C组、D组和E组间总体比较差异没有统计学意义（F=0.033,P=0.998）。Masson染色显示,与A组、B组、C组和D组比较,E组大鼠CCSM数量显著增多（P<0.001,P<0.001,P=0.001和P<0.001）。结论1.大鼠CCSM细胞在高血糖状态下会发生表型转化现象,即由收缩型向增殖型转化。糖尿病性大鼠CCSM细胞增殖表型与ED发生有关。2. myocardin和SRF在糖尿病性大鼠CCSM组织中的表达下降,myocardin和SRF可能参与了大鼠CCSM细胞收缩表型的维持。3. myocardin基因治疗可改善糖尿病性大鼠阴茎勃起功能,其机制可能是通过调控CCSM细胞表型起作用。