目的:艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是严重威胁人类健康的传染病,由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起,迄今仍无法根治。由于HIV-1的高度复制特性、高突变率以及高重组率造成了病毒的高度遗传变异性,将HIV-1分为不同的组、亚型、循环重组型(Circulating Recombinant Forms,CRFs)及独特的重组形式(Unique Recombinant Forms,URFs)。CRF01_AE是世界上发现最早的重组型HIV-1毒株,起源于非洲中部,目前已在全球范围内流行蔓延。CRF01_AE最早于上世纪90年代中期传入我国,自2007年以后,在我国各地及不同传播途径中的分布迅速上升,成为我国主要的HIV流行株。高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)可有效抑制病毒的复制,由于HAART的普及以及抗病毒药物种类的不断增加,大多数患者能够实现病毒学的完全抑制,然而仍有部分患者因出现耐药导致抗病毒治疗的失败。由于耐药株传播造成的感染还会引起未接受过治疗的感染者表现出对药物的抗性,因此国际艾滋病治疗指南建议在用药前和药物治疗中均进行耐药监测。基因型耐药检测是目前检测HIV耐药性最常用的方法,由于主要流行B亚型毒株的发达国家率先开展抗病毒治疗和耐药研究工作,对B亚型毒株耐药规律的研究远比其他亚型毒株更为深入。因此目前对于不同亚型和重组型病毒的基因型耐药检测主要根据B亚型毒株所得出的研究数据。但迄今的研究数据已经提示亚型间基因多态性的显著差异可影响病毒的耐药通路,非B亚型毒株可能具有独特的耐药特征。此外,无论是体内实验还是体外实验,均曾出现过基因型和表型耐药结果的不一致,尤其是非B亚型病毒,进一步说明了根据B亚型病毒特点所总结出的耐药特征可能不完全适用于非B毒株。上述研究均提示,深入研究亚型特异性耐药突变规律,解析不同亚型毒株特定突变对抗病毒药物敏感性的影响及其耐药机制,对于科学预估临床耐药性、优化治疗方案至关重要。虽然CRF01_AE已经成为全球广泛流行的主要流行重组毒株之一,而且其耐药特征也存在与B亚型毒株的不同之处,但目前对于CRF01_AE毒株的耐药性、耐药相关突变和病毒的适应性尚缺乏系统研究。本课题组前期研究发现CRF01_AE感染者在抗病毒治疗后,S68G突变率出现明显增幅且突变意义不明确。通过生物信息学软件分析各突变位点的相关关系,提示K65R与S68G之间存在显著的关联性。既往研究也提示K65R和S68G存在一定的相关性,但尚未明确S68G的意义。结合以上背景,本研究首先利用美国斯坦福耐药数据库进行深度挖掘,对比数据库中未接受抗病毒治疗和接受抗病毒治疗后S68G突变率的变化,以及不同亚型及重组型毒株中K65R联合S68G的频率;其次,通过深度测序技术分析同一研究对象体内不同时间点的病毒基因序列,观察K65R与S68G发生的时序性变化及两者之间的关系,以明确S68G治疗前后突变率的增幅是否与K65R有关;接着,构建含CRF01_AE感染者pol基因的假病毒及感染性病毒,最大程度的保持CRF01_AE毒株基因序列的特征,通过表型耐药实验及生长竞争实验进一步探索CRF01_AE毒株中S68G与K65R的联合对病毒表型的影响,为科学解读CRF01_AE感染者耐药突变,合理应用抗病毒药物提供实验室依据。研究方法:1、研究对象截至2016年7月,中国医科大学附属第一医院红丝带门诊共计2300名HIV-1感染者接受HAART治疗,56名携带K65R突变的患者中,14名同时携带S68G突变。由于本研究拟观察突变的动态演变过程,以及考虑到表型耐药试验中回复多个突变会影响病毒的活性,因此排除随访时间短及含多种NRTIs相关突变的患者。最后纳入4名患者作为本实验研究对象。2、分析美国斯坦福大学数据库序列特征对比分析美国斯坦福大学数据库(https://hivdb.stanford.edu/)中经治和未治的病毒序列中S68G发生频率的变化,并比较抗病毒药物选择出的所有携带K65R突变的毒株中同时含有S68G的比例。3、病毒基因型检测按照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明从血浆中提取病毒RNA。为了观察HIV pol基因组65位和68位氨基酸突变的发生发展关系,对RT基因48~96位氨基酸的编码区序列进行扩增。将PCR产物进行纯化与定量,构建深度测序文库,文库标准化后进行上机检测。应用HyDRA在线分析软件(https://hydra.canada.ca)统计RT基因48~96位氨基酸的突变率。4、表型耐药性检测体外表型耐药检测参考PhenoSense?方法。扩增病毒pol基因编码蛋白酶1~99氨基酸和逆转录酶1~240氨基酸的序列。通过Overlap-PCR技术将S68G突变回复至野生型,构建含K65R/S68G双突变和K65R单突变的毒株。分别将含K65R/S68G双突变和含K65R单突变的CRF01_AE感染者pol基因置换到假病毒骨架质粒pNL4-3-ΔE-Luc,与包膜质粒VSVG共转染293-T细胞进行假病毒包装。根据Spearman-Karber法进行病毒感染力滴定。以TZM-bl细胞为靶细胞进行表型耐药检测。根据突变株IC50(半数抑制浓度)与实验室野生株IC50相比的倍数变化(FC)判定耐药水平。采用SPSS18.0统计软件行配对t检验,分析含K65R/S68G双突变株和将K65R单突变株FC的差异,若P<0.05为差异有统计学意义。5、基因型与表型耐药结果对比表型耐药结果判读根据PhenoSense?方法得到的药物敏感性与临床结果数据的相关性确定(来源于Monogram Biosciences公司)。具体的参考范围为:AZT(1.9),TDF(1.4~4),3TC(3.5)。将小于临界值下限判读为敏感(S),大于临界值上限判读为耐药(R),中间为部分耐药(P)。基因型结果判读参照HIVdb(8.4)、ANRS(2016)、Rega(9.0.1)和GRADE(2017)。6、生长竞争实验构建含K65R/S68G双突变和K65R单突变的CRF01_AE毒株pol基因的感染性克隆。根据Spearman-Karber法进行病毒感染力滴定。分别将含K65R单突变和含K65R/S68G双突变的毒株以50%:50%、90%:10%和40%:60%进行混合,将病毒储存液MOI值调整至0.005,感染3×10~5正常人来源的PBMC,每个比例三个平行孔。分别在感染后第5天、7天、10天、13天移除半量培养上清,并补充等量的细胞培养液。从上清中提取病毒RNA,然后进行PCR扩增及测序。应用在线分析软件(https://indra.mullins.microbiol.washington.edu/)统计含不同突变组合毒株所占比例。结果:1、CRF01_AE毒株中K65R与S68G之间存在明显的相关性通过对比分析美国斯坦福大学耐药数据库中未接受抗病毒治疗和接受抗病毒治疗后不同亚型毒株S68G突变率的变化,发现S68G由未治疗的3.5%(2617/73806)上升至治疗后的6.5%(4690/72522)。除F亚型毒株外,其他亚型及重组型毒株在接受抗病毒治疗后S68G发生频率均出现了明显的上升,其中增幅最为明显的为CRF01_AE毒株,治疗后上升了约10%。除此之外,还发现所有亚型及重组型毒株在抗病毒治疗后,携带K65R突变的病毒序列中68位点均具有极高的突变率,最常见的是S突变为G/N/D/K/R,其中突变为G的频率最高,CRF01_AE毒株中含K65R突变的同时携带S68G的频率甚至高达61.8%。2、K65R有助于病毒进化出S68G通过深度测序技术分析了4名CRF01_AE感染者体内不同时间点的血浆病毒基因序列,以观察K65R与S68G发生的时序性变化及两者之间的关系。结果显示3例患者在药物选择压力下,首先产生K65R突变,其中2例在K65R突变出现的同时,检出部分毒株同时携带S68G突变,在后续随访点中,最后几乎所有病毒序列均携带了这两个突变,另一例则明确首先检出K65R突变,此后部分毒株进一步产生S68G突变。而另一名患者,在未经治疗时,几乎所有体内病毒均存在S68G的自然多态性,该病例在治疗7个月时,体内部分毒株突变产生了K65R,检出K65R突变的时间晚于前述3例病例。3、S68G并不影响K65R突变株的药物敏感性通过深度测序提示K65R能够促进病毒选择出S68G突变,为了明确病毒是否通过S68G突变增加病毒耐药性,本研究首先将S68G回复至野生型作为对照,构建假病毒模型进行表型耐药检测。由于301635患者第四个随访点携带K65R的频率较低,通过克隆的方法挑取劣势准种失败,因此未纳入表型研究中。体外表型耐药实验提示S68G并不影响K65R突变株对AZT、TDF和3TC的药物敏感性。4、基因型结果高估了K65R对TDF的耐药水平通过表型耐药结果与基因型结果的对比发现,两种方法均认为突变株对AZT敏感,对3TC耐药,判读结果基本一致。但值得注意的是,基因型解释算法认为携带K65R突变的病毒对TDF高度耐药,但表型结果却显示为部分敏感,很明显基因型结果高估了K65R突变株对TDF的耐药水平。5.含K65R和S68G双突变的毒株复制适应性更强由于S68G突变并不会改变K65R突变株的NRTIs耐药水平,因此推测S68G被K65R选择出的原因可能是因为它能补偿K65R突变株的病毒复制适应性损失。为了验证这一假设,本研究通过生长竞争实验观察不同突变组合病毒的复制适应性。结果显示以不同比例将不同突变株混合培养,均发现随着培养时间的延长携带K65R单突变的毒株所占的比例逐渐下降,而携带K65R和S68G双突变的毒株却逐渐上升,提示含双突变的毒株具有更强的复制适应性,能够获得生长上的优势。结论:在药物选择压力下,CRF01_AE感染者常首先选择出K65R,继而选择出S68G。S68G是CRF01_AE毒株常见的自然多态性位点,其本身对药物敏感性无影响,但与主要耐药突变K65R联合存在时,可使K65R突变耐药株的复制适应性提高。此外,对于CRF01_AE毒株,耐药基因型解读规则中对K65R的耐药性判读存在高估,需要进一步评估其对药物敏感性的影响程度。