血吸虫病(Schistosomiasis)严重危害人类生命健康,在我国主要流行日本血吸虫病。随着防治工作的不断推进,截止到2014年底,我国大约还有11万的血吸虫病患者,但是积累的既往患者人数还很多,他们仍有罹患晚期血吸虫病的可能。日本血吸虫病造成的病理损害主要是虫卵在肝脏沉积形成的肉芽肿反应以及继发的肝脏纤维化。传播阻断后血吸虫病是指在对患者进行杀虫治疗后,虽然体内血吸虫已经被消灭,但是患者的肝纤维化仍可持续发展,以至发展到晚期血吸虫病阶段。因此,在进行病原治疗之后,对血吸虫病患者进行肝纤维化管控,阻止肝脏病变的持续发展,是当前血吸虫病防治中不容忽视的突出问题。吡喹酮(Praziquantel,PZQ)作为抗血吸虫的首选药物,具有高效,安全,副作用少的特点。除对吸虫、绦虫等蠕虫具有杀虫作用外,近年来有研究者发现吡喹酮可以直接作用于宿主的组织和细胞发挥药效。本实验室的前期研究发现,在慢性期日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮的长疗程治疗可以抑制小鼠肝脏纤维化的发展,但详细机制尚未明了。本文将从TGF-β/Smad信号通路入手,研究吡喹酮对该通路的影响,进一步揭示吡喹酮抗纤维化作用的机制。为了避免吡喹酮自身杀虫作用对血吸虫感染肝纤维化模型的影响,我们建立四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型。采用分子生物学和细胞学技术,检测吡喹酮对四氯化碳肝纤维化模型小鼠肝组织的纤维化相关指标以及TGF-β/Smad信号通路相关因子的影响,在此基础上进一步检测吡喹酮对外源性TGF-β1刺激后的LX-2细胞凋亡、细胞周期,纤维化相关指标以及TGF-β/Smad信号通路的影响,并利用siRNA干扰技术证明TGF-β/Smad信号通路在吡喹酮抗纤维化中的关键作用,以期深入阐明吡喹酮抗肝纤维化的作用机制。本研究获得如下主要结果:1.四氯化碳诱导肝纤维化小鼠经吡喹酮治疗后肝脏病理状况明显改善给予小鼠25%四氯化碳腹腔注射4周,每周2次,建立肝纤维化模型。分别设立正常组、模型组、吡喹酮给药组(300mg/kgX 12h)。结果显示,模型组ALT,AST肝功能指标相比于正常组显著升高,给予吡喹酮治疗4周后可使其明显降低。肝脏组织病理切片HE染色结果显示,正常组小鼠肝组织肝小叶网状纤维结构完整,分界清晰,无炎性细胞浸润及纤维组织异常增生,肝窦及汇管区无异常。模型组小鼠肝组织显示病理性损伤改变,肝小叶失去正常结构,肝细胞索排列紊乱,伴有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润,小叶周围纤维组织增生明显,部分形成假小叶。吡喹酮治疗组肝脏结构完整,纤维化程度低,肝索无破坏,小叶内可见散在肝细胞气球样病变,汇管区未见炎性细胞浸润。以上结果提示:吡喹酮持续治疗4周对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型的肝脏功能和组织结构有显著改善作用。2.四氯化碳诱导肝纤维化小鼠经吡喹酮治疗后肝纤维化指标显著下降为了观察吡喹酮抗纤维化的作用,对肝脏组织进行免疫组化分析,分别检测了 Col1α1、α-SMA等纤维化相关指标,用Image-ProPlus软件分析Col1α1、α-SMA蛋白显色的累计光密度/总面积的比值。可见正常组Col1α1、α-SMA在肝组织汇管区少量阳性表达;模型组Col1α1、α-SMA在肝组织内阳性表达的面积显著增加;吡喹酮治疗组Col1α1、α-SMA在肝组织内阳性表达的面积显著少于模型对照组,趋于正常。进一步用Western blot方法检测了吡喹酮治疗后小鼠原代分离肝星状细胞(heβatic stellate cells,HSCs)纤维化相关蛋白Col1α1、α-SMA的表达水平。发现吡喹酮持续治疗4周组与四氯化碳诱导的模型组相比,原代分离肝星状细胞的Col1α1、α-SMA蛋白的表达显著性降低。这些结果提示:吡喹酮持续治疗4周能够显著性抑制小鼠肝星状细胞的纤维化功能。3.吡喹酮治疗抑制四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的TGF-β/Smad信号通路为探讨吡喹酮治疗抑制小鼠肝纤维化形成的机制,我们运用免疫组化和Western blot方法观察了小鼠肝组织和肝星状细胞中TGF-β/Smad信号通路相关phospho-Smad2/3,Smad2/3,Smad7蛋白表达水平。发现批喹酮治疗组与模型组相比,βhosβho-Smad2/3的表达降低,竞争性拮抗的Smad7表达升高。结果提示:吡喹酮持续治疗4周可以抑制四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的TGF-β/Smad信号通路。4.吡喹酮体外抑制人肝星状细胞系LX-2的活化以及TGF-β/Smad信号通路为了进一步明确吡喹酮对肝星状细胞纤维化作用的影响,我们观察了吡喹酮体外对TGF-β1诱导活化的人肝星状细胞系LX-2活化以及TGF-β/Smad信号通路的作用。分别利用qRT-PCR和Western blot检测了活化相关的Col1α1、α-SMA以及TGF-β/Smad信号通路相关的Smad2/3,Smad4,Smad7的基因和蛋白表达水平。结果发现,吡喹酮体外可以下调LX-2的Smad3、上调Smad7的基因表达;进一步利用Western blot检测总的Smad2/3以及Smad2/3磷酸化蛋白水平,发现吡喹酮体外可以抑制LX-2的Smad2/3磷酸化水平。结果表明:吡喹酮在体外可以直接抑制肝星状细胞的活化以及TGF-β/Smad信号通路。5.Smad7是吡喹酮干预TGF-β/Smad通路抗肝纤维化作用的重要靶点为了验证吡喹酮通过上调Smad7表达抑制TGF-β/Smad信号通路的抗纤维化作用,我们利用siRNA转染LX-2细胞进而干扰Smad7基因表达,在敲低Smad7基因表达的LX-2细胞中加入吡喹酮刺激,qRT-PCR检测了 LX-2细胞纤维化相关功能基因表达。结果显示,LX-2细胞Col1α1的基因表达在吡喹酮刺激后下降,而在敲低Smad7表达后Col1α1的基因表达则不再下降,无统计学差异,同时NC-siRNA干扰的细胞吡喹酮刺激依然可以使Col1α1的基因表达下降。结果提示我们,吡喹酮可能通过上调Smad7的表达抑制TGF-β/Smad通路,从而抑制肝星状细胞的纤维化功能。综上所述,本研究发现,吡喹酮治疗可以通过抑制肝星状细胞的TGF-β/Smad信号通路干预肝星状细胞的活化以及细胞外基质的合成,从而抑制肝纤维化形成。研究结果初步揭示了吡喹酮直接抑制肝脏纤维化发展的机制,有助于进一步认识吡喹酮新的药理作用,据此提出治疗血吸虫病的新策略,并有可能发展成为新的抗纤维化药物,应用于其他病因肝纤维化疾病的治疗。