[目的]　　从整体、细胞及分子水平，探讨中药加味黄芪桂枝五物汤对糖尿病神经病大鼠神经行为学、痛阈值、表皮神经纤维密度和血清中miR-146a、白介素1β、肿瘤坏死因子α的影响，以及中药含药血清对高糖培养背根神经节神经元miR-146a促发炎症免疫代谢通路的影响及靶点细胞因子，阐明益气活血中药治疗糖尿病神经病变优势及相关作用机制。　　[方法]　　方法1:加味黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠神经行为学影响　　采用一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg的方法制造糖尿病大鼠模型。随机分为6组:正常对照组、模型组、英夫利昔单抗组及加味黄芪桂枝五物汤小剂量、中剂量和大剂量组，每组各12只。血糖高于16.7 mmol/L视为糖尿病大鼠，标本不合格者剔除。并于造模前、造模后1、2、3、4、5、6周进行50％机械缩足阈值(PWT)测定，较造模前低10％以上，与正常比较有显著差异(p＜0.05)，确定为糖尿病神经病变(DPN)模型复制成功。成模后予灌胃给药，加味黄芪桂枝五物汤小、中、大剂量组分别按成人剂量5、10、20倍给药;作为对照，正常组、模型组和英夫利昔单抗组STZ大鼠接受生理盐水灌胃，在8周、12周、16周使用英夫利昔单抗(3 mg/kg)肌注3次，其余各组在8周、12周、16周予以生理盐水肌注3次。检测各组治疗后1、4、8、12、16周的血糖、坐骨神经传导速度(NCV)、机械痛阈、热痛阈的变化。所有实验大鼠于灌胃16周后处死，取背部5×8cm2全层皮肤，行PGP9.5免疫组化染色，光镜和透射电镜下观察表皮神经细胞形态、神经纤维分布情况。腹主动脉采血qRT-PCR法检测大鼠血清中miR-146a表达，采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α的表达变化。　　方法2:加味黄芪桂枝五物汤含药血清对背根神经节神经元炎症通路及细胞凋亡的影响　　(1) SPF级雄性SD大鼠，随机分为2组，10只予以加味黄芪桂枝五物汤灌胃，10只予以生理盐水灌胃，制备加味黄芪桂枝五物汤含药血清和正常对照血清。(2)选用50mmol/L葡萄糖浓度为模拟高糖对DRGn细胞的损伤作用的浓度，此浓度可显著抑制DRGn细胞活性。体外实验时选1∶2比例稀释，获得低浓度含药血清，现配现用，避免反复冻融。取新生SD大鼠，麻醉并处死后用显微镊摘除L4-L6段脊髓DRG，采用胰蛋白酶消化法，随机分成5组，正常对照组、单纯高糖培养基组、中药含药血清组、miR-146a模拟剂组、中药+模拟剂组。正常对照组加入等量的普通培养液，其他四组加入50mmol/L葡萄糖培养液，再分别加入中药含药血清、miR-146a模拟剂以及中药血清+模拟剂，置于培养箱中培养，48h后更换培养液，换液后48h提取细胞总RNA。(3)采用荧光定量Real-time PCR检测miR-146a、TRAF6mRNA、IRAK1 mRNA、NF-κ B p65mRNA、TNF-α mRNA、Caspase-3mRNA水平，WesternBlot法检测DRGn神经元中TRAF6、IRAK1、NF-κ B p65、TNF-α、Caspase-3蛋白的含量。　　[结果]　　结果：1:(1)各组血糖比较:造模后，DPN模型组大鼠血糖与正常组相比均显著升高(P＜0.01)。药物干预后各组在不同时间点，各治疗组血糖与模型组相比无差异(P＞0.05)(2)运动功能测定:进行大鼠坐骨神经传导速度方面比较，各组药物干预后在不同时间点与正常组相比，模型组大鼠坐骨神经传导速度明显减慢;加味黄芪桂枝五物汤组及英夫利昔单抗组均能延缓糖尿病大鼠坐骨神经传导速度的减慢，与模型组8周相比差异显著(P＜0.05)，12周和16周相比有显著差异(P＜0.01);中药组的疗效优于英夫利昔单抗组，二者相比差异显著(P＜0.05)，中药组各组间比较，高剂量组在16周时有更加明显的改善效果(P＜0.05)。(3)疼痛行为测定:采取机械痛阈和热痛阈测定，与注射前的机械痛阈和基础热痛阈相比:各组药物干预后在不同时间点与正常组相比，模型组大鼠机械缩足反应阈值(MwT)和热刺激缩足反射潜伏期(TWL)明显缩短，差异显著(P＜0.05);加味黄芪桂枝五物汤组及英夫利昔单抗组均能改善糖尿病大鼠MWT和TWL，与模型组8周相比差异显著(P＜0.05)，12周和16周相比有显著差异(P＜0.01);中药组的疗效劣于英夫利昔单抗组，二者相比差异显著(P＜0.05)。(4)表皮组织学观察:透射电镜下模型组比正常组细胞核不规则，核染色质部分凝集，细胞器减少，线粒体嵴断裂，神经纤维的微丝微管排列紊乱、减少;有髓神经髓鞘被挤压、溶解，脱髓鞘样改变，表皮神经纤维密度分布稀疏;而中药各组相比模型组，线粒体嵴少量断裂，纤维丰富，神经纤维的微丝微管排列相对正常，数量可，有髓神经髓鞘轻度脱髓鞘改变，表皮神经纤维密度分布较密集。(5)腹主动脉血清中miR-146a和TNF-α、IL-1β比较:各组药物干预后16周与正常组相比，DPN模型组大鼠血清发现miR-146a下调，IL-1β、TNF-α上调，加味黄芪桂枝五物汤组及英夫利昔单抗组均能升高miR-146a，降低IL-1β、TNF-α，与模型组相比差异显著(P＜0.05);中药组的疗效劣于英夫利息单抗组，二者相比差异显著(P＜0.05)，中药组进行组间比较，高剂量组有更加明显的改善效果(P＜0.05)。　　结果2:(1) RT-PCR检测各组DRGn miR-146a表达结果:各个实验组与正常培养基组相比较，miR-146a表达均明显降低，统计学上有显著差异(P＜0.01);中药含药血清组较高糖血清组比较miR-146a表达升高(P＜0.05);miR-146a模拟剂组较高糖血清组比较miR-146a表达显著升高(P＜0.01);中药含药血清较miR-146a模拟剂组无明显差异，统计学上未见明显差异(P＞0.05);而模拟剂+中药组较miR-146a模拟剂组比较显著升高miR-146a，具有明显差异(P＜0.01)。(2)各组DRGn TRAF6、IRAK1、NF-κB p65、TNF-α、Caspase-3蛋白和mRNA表达结果:与正常组比较，高糖培养基组的TRAF6、IRAK1NF-κ B p65、TNF-α、Caspase-3蛋白和mRNA表达显著升高(P＜0.01)，其他实验组蛋白和mRNA表达均降低，具有统计学差异(P＜0.05);中药含药血清组较高糖培养基组比较TRAF6、IRAK1、NF-κ B p65、TNF-α、Caspase-3蛋白和mRNA表达降低(P＜0.05);miR-146a模拟剂组较高糖培养基组比较TRAF6、IRAK1 NF-κB p65、TNF-α、Caspase-3蛋白和mRNA表达显著降低(P＜0.01);中药含药血清较miR-146a模拟剂组无明显差异，统计学上未见明显差异(P＞0.05);而模拟剂+中药组较miR-146a模拟剂组比较显著降低TRAF6、IRAK1NF-κ B p65、TNF-α、Caspase-3蛋白和mRNA表达，具有明显差异(P＜0.01)。(3) DRGn细胞NF-κ B p65细胞免疫荧光:激光共聚焦照片显示:NF-κ B p65蛋白亚基在单纯高糖培养基组表达水平升高，并大量转运至细胞核。相比于单纯高糖培养基组，中药含药血清组、miR-146a模拟剂组和模拟剂+中药组均可降低NF-κ B p65蛋白亚基的表达和核转运，其中模拟剂+中药组效果较好。　　[结论]　　结论：1:加味黄芪桂枝五物汤提高糖尿病周围神经病变大鼠运动神经传导速度和提高热痛阈值和机械痛阈值，对表皮细胞线粒体有保护作用，对神经纤维的微丝微管和有髓纤维均有修复作用，可提高表皮神经纤维密度，具有防治DPN大鼠周围神经组织损伤的作用，它的作用位点可能位于miR-146a调控炎症通路，通过上调miR-146a，进而抑制IL-1β，TNF-α激活，从而减少炎症因子的表达，减轻炎症反应。　　结论：2:加味黄芪桂枝五物汤可以明显升高糖条件下大鼠背根神经节细胞miR-146a，降低TRAF6、IRAK1、NF-κ B p65、TNF-α、Caspase3蛋白和mRNA表达，它的作用可能具有类似miR-146a模拟剂的作用，可以阻止NF-κ B p65从细胞质转入细胞核内引起的促凋亡作用。中药具有多方位，多靶点的调节炎症因子，抑制细胞凋亡。