非洲猪瘟(African Swine Fever, ASF)是由ASF病毒(ASFV)引起的猪的急性、烈性传染病,以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征,强毒株感染的发病率和死亡率可达100%,对养猪业危害巨大,是各国严密防范的传染病。目前我国尚无本病的发生,但随着国际贸易的增强,国家间人员的流通,在国际机场和港口等地点应严防该病的传入,因此事先建立快速诊断方法十分必要。VP72是ASFV主要的衣壳蛋白,占病毒粒子蛋白含量的32%,非洲猪瘟病毒是有限的几个不能引起中和反应的病毒之一,但存在针对VP72的中和抗体。并且该蛋白在不同毒株之间高度保守,是诊断ASF最常用的目标抗原。因此通过主要衣壳蛋白VP72建立一种ASF的诊断方法具有可行性。单克隆抗体特异性强,被认为是鉴定病毒因子的可靠方法,与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应,已用于多种病毒感染的诊断。为了制备特异的单克隆抗体,本研究使用重组大肠杆菌表达的GST-VP72融合蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,三次免疫后取脾脏B细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,以纯化的可溶性GST-VP72S为包被抗原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆同时筛除抗GST阳性克隆,获得了五株稳定分泌VP72特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定分泌的单克隆抗体为IgG2b,腹水效价可达216。用GST-VP72S融合蛋白包被ELISA反应板,经方阵滴定法确定碳酸盐缓冲液(pH9.6)的包被效果优于PBS和生理盐水,37℃/2h与4℃/过夜的包被效果差异不大,最佳包被抗原浓度为4μg/ml,5%脱脂乳4℃过夜的封闭效果优于含10%小牛血清的PBST和1%BSA,用含0.5%Tween -20和0.5M NaCl的PBS洗涤液可增强反应特异性和灵敏性,腹水单抗的工作浓度为1:800,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的工作浓度为1:1000,建立的检测ASFV抗体的间接ELISA具有较高的特异性和灵敏性。该酶标板在4℃至少可以保存7天,-20℃至少可以保存60天。