研究背景结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内排名第三位,死亡率排名第二位。遗传、饮食、肥胖和吸烟等因素与结直肠癌的发生密切相关。目前临床上对于结直肠癌的治疗采取以手术为主的综合治疗模式。在过去几十年中,尽管外科手术技术、化疗、放疗等取得了极大的进步,但其预后仍不容乐观,据统计,2018年共有88万人死于结直肠癌。肿瘤的复发和转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。因此寻找结直肠癌诊断与治疗的新方式至关重要。结直肠癌的发生与发展是一种多步骤、多途径的生物学进程,包括基因突变,细胞增殖、分化和凋亡的失衡。环状RNA（Circular RNA,circRNA）是近年来发现的一种广泛存在于多种生物细胞中的非编码RNA。与一般线性RNA分子不同,circRNA为闭合环状结构,没有5’端和3’端结构。近期许多研究发现circRNA可以调控结直肠癌发生发展过程中的关键基因、蛋白的表达,与结直肠癌的发生发展密切相关。此外,circRNA具有高丰富、高稳定性、组织特异性表达和阶段特异性表达等特性。因此,研究circRNA不仅可以进一步了解结直肠癌的发病机制,而且对结直肠癌的诊断和治疗具有重要意义。实验目的对结直肠癌及癌旁组织进行基因芯片分析,筛选差异表达的circRNA。在结直肠癌细胞中对目的分子进行验证,并进一步探究其在结直肠癌中的诊断与治疗作用。研究方法1.结直肠癌组织circRNA表达谱分析收集6组结直肠癌组织及其邻近的正常黏膜组织,通过芯片测序检测circRNA表达谱,证实了 circRNA在结直肠癌中异常表达。选择差异表达较为明显的hsa_circ₀016866作为目的分子,对其进行进一步研究。2.在结直肠癌细胞系中 hsa_circ₀016866表达的分析验证通过荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）在结直肠癌细胞系DLD1、SW480、HCT8及正常肠上皮细胞系HCO中检测hsa_circ₀016866的表达。3.在结直肠癌组织和血清中hsa_circ₀016866表达的分析验证通过qRT-PCR在结直肠癌组织及其癌旁组织中检测hsa_circ₀016866的表达水平;在结直肠癌患者血清及健康人血清中检测hsa_circ₀016866的表达水平,并将同一患者手术前与手术后血清中hsa_circ₀016866表达水平进行对比。4.Hsa_circ₀016866在结直肠癌细胞中功能研究通过qRT-PCR筛选hsa_circ₀016866表达水平较高的结直肠癌细胞系进行细胞功能实验。将设计的小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）转染至结直肠癌细胞中以降低hsa_circ₀016866表达水平。通过CCK-8细胞增殖实验和细胞克隆形成实验检测hsa_circ₀016866表达水平对结直肠癌细胞增殖能力影响。通过Transwell小室法探究hsa_circ₀016866表达水平对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响;利用流式细胞技术检测细胞周期变化和细胞凋亡水平。5.Hsa_circ₀016866在结直肠癌组织和血浆中表达水平作为结直肠癌肿瘤标志物的可行性分析将hsa_circ₀016866表达水平与结直肠癌患者临床病理特征进行相关性分析。建立生存模型分析hsa_circ₀016866表达水平与结直肠癌患者预后的关系。绘制接收者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）评价hsa_circ₀016866在结直肠癌诊断方面的价值。结果1.结直肠癌组织circRNA测序分析共发现67种在结直肠癌组织中异常表达的circRNA分子,表达上调和表达下调分别为16和51。选择表达差异较为明显的hsa_circ₀016866进一步研究。2.Hsa_circ₀016866在结直肠癌细胞系中表达上调qRT-PCR结果表明,hsa_circ₀016866在结直肠癌细胞系SW480、HCT8、DLD1中的表达均明显高于正常肠上皮细胞系HCO。3.Hsa_circ₀016866在结直肠癌组织和血清中表达上调相对于正常标本,hsa_circ₀016866在结直肠癌组织及血清中表达均明显上调。对于同一结直肠癌患者手术后与手术前血清中hsa_circ₀016866表达水平相比,手术后表达水平明显下调。4.Hsa_circ₀016866促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移利用 siRNA 降低 hsa_circ₀016866 表达水平,qRT-PCR 表明si-hsa_circ₀016866-1 转染 SW480 和 DLD1 细胞时,hsa_circ₀016866 下调比例较高,因此使用si-hsa_circ₀016866-1、SW480和DLD1细胞进行细胞功能实验。CCK-8细胞增殖实验和细胞克隆形成实验表明hsa_circ₀016866表达水平与结直肠癌细胞增殖能力呈正相关。Transwell小室法表明,降低hsa_circ₀016866可以抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭能力。通过流式细胞技术表明,hsa_circ₀016866的表达水平下降后,细胞周期阻滞于GO/G1期。然而,干扰Hsa_circ₀016866表达对细胞凋亡没有明显影响。5.Hsa_circ₀016866可以作为结直肠癌的肿瘤标志物统计分析表明,hsa_circ₀016866在结直肠癌组织中的表达水平与肿瘤远处转移、TNM分期及周围神经浸润有关。单因素分析与多因素分析显示hsa_circ₀016866表达水平是结直肠预后的独立影响因子。ROC曲线显示hsa_circ₀016866 其曲线下方的面积大小（Area Under Curve,AUC）为 0.675,在结直肠癌诊断方面具有较高价值。结论Hsa_circ₀016866可以作为结直肠癌的肿瘤标志物,其表达水平在结直肠癌组织、血清及细胞中的表达水平均明显上调,与预后不良相关。降低hsa_circ₀016866表达水平可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,提示hsa_circ₀016866可以促进结直肠癌的增殖、侵袭和迁移能力。本研究为结直肠癌的诊断及治疗提供了研究基础。