尘肺病是全世界范围内常见的职业性疾病,尤其以发展中国家为主。病人长期暴露于高浓度的粉尘颗粒环境中,使得粉尘颗粒在肺部不断聚集,造成肺部慢性炎症和不可逆的纤维化反应发生,最终导致呼吸衰竭和死亡。尘肺病的发病机制极其复杂,学术界提出多种学说解释尘肺病发病机制,但大多没有得到有效的实验验证,且目前尚未有彻底治疗纤维化的临床措施。可变剪接是真核生物基因调控表达的一个重要方式,是基因表达复杂性的主要来源,并在生物生长发育和细胞分化过程中具有重要意义。生物体或细胞受到外界强烈刺激后,会产生应激反应,并在转录水平发生改变。目前已经证明可变剪接与多种疾病的发生具有密切的联系,因此可变剪接被认为是鉴定疾病发生的新的诊断生物标记或新的治疗方法的基础。尘肺病的形成需要经历损伤、炎症、成纤维细胞增殖迁移和纤维化4个阶段。在二氧化硅的持续刺激下,巨噬细胞作为免疫系统的重要防线,会分泌大量的细胞因子、趋化因子,例如IL6、IL1-β、TNF-α、TGF-β等。TGF-β因子在炎症反应过程中具有重要意义,可以刺激成纤维细胞增殖活化、促进纤维化发展。TGF-β所在的细胞信号通路参与人体多种代谢途径,其中TGF-β—Smad3信号通路被证明与肺部纤维化发展具有紧密联系。本论文从TGF-β—Smad3信号通路与可变剪接两个角度出发,研究尘肺病炎症与纤维化阶段的联系,探究基因可变剪接事件在纤维化过程中的表达变化。本文首先检测尘肺动物模型中可变剪接事件的发生,其次从单细胞角度建立细胞模型,探究巨噬细胞与成纤维细胞在尘肺病发病过程中的生物响应及两者之间的级联反应。1、尘肺病动物模型体内可变剪接事件的验证:依据SiO₂胁迫下尘肺病大鼠纤维化肺组织高通量测序分析结果,选取具有显著性差异的基因可变剪接事件进行实验验证分析。使用PCR方法,鉴定了6个发生差异可变剪接的基因。相对于对照组,二氧化硅胁迫下肺组织的Dgkg、Tle4基因相关外显子剪接保留率没有发生变化,Ect2l、Mocs2、Rapgef6等基因相关外显子剪接的保留率上升,而Phtf1基因外显子保留率下降。2、二氧化硅胁迫下巨噬细胞的生物学相关响应:以3×10⁵ Cells/mL浓度接种巨噬细胞,过夜培养后,以100 ng/mL LPS与二氧化硅同时胁迫巨噬细胞48 h。胁迫后的巨噬细胞IL1-β、TNF-α基因的表达水平明显升高。3、二氧化硅胁迫下巨噬细胞与成纤维细胞的级联响应:以3×10⁵ Cells/mL浓度接种巨噬细胞,过夜培养后,以100 ng/mL LPS与200μg/mL SiO₂同时胁迫巨噬细胞48h。成纤维细胞以5×10⁵ Cells/mL接种于Transwell细胞小室中,贴壁后继续培养24h。将已贴壁24 h的成纤维细胞与胁迫24 h后的巨噬细胞共培养24 h。共培养后的巨噬细胞出现体积增大、细胞破碎及长触角现象,成纤维细胞的数量增加、细胞呈纤长的不规则形态。共培养24 h后的成纤维细胞胶原基因的表达量升高。4、TGF-β因子刺激下成纤维细胞的生物学效应:成纤维细胞以5×10⁵ Cells/mL浓度接种于六孔板中,贴壁后将培养液更换为含0.5%FBS的培养液,继续培养24 h。添加10 ng/mL TGF-β因子,刺激成纤维细胞12 h。TGF-β刺激后成纤维细胞的胶原基因及α-SMA基因表达量升高。本文验证了动物模型中在纤维化阶段若干发生差异可变剪接的事件,同时建立了二氧化硅胁迫下的细胞模型。为下一步的研究奠定了坚实的基础,为尘肺病发病机制的研究和治疗提供了一定的理论参考。