论文部分内容阅读
研究目的：DNA聚合酶6是真核细胞催化DNA合成的主要酶，与细胞周期密切相关。DNA聚合酶6的催化亚基p125的编码基因为POLD1，该基因表达受到细胞周期调控，但对于DNA聚合酶6接受细胞周期调控完成DNA复制功能的具体机制仍不清楚。本研究对POLD1基因启动子的调控元件及转录调控机制进行研究，结果有助于进一步研究POLD1基因细胞周期依赖性表达的机制。DNA聚合酶6的调节亚基p50的编码基因为POLD2，该蛋白除了参与DNA复制过程外，可能也参与了其他细胞事件，本研究对p50蛋白功能进行初步研究，结果有助于全面认识DNA聚合酶6的调节亚基功能。
主要方法及结果：(1)构建POLD1基因启动子片段缺失突变体，通过细胞周期同步化等方法，研究POLD1基因启动子的核心转录区，结果表明POLD1基因启动子的核心转录区为-585～+49，并且其启动子活性呈细胞周期依赖性变化。(2)通过序列比对分析，发现并鉴定了POLD1基因启动子中的CDE/CHR元件，结果表明该元件与POLDI基因启动子活性的细胞周期性变化密切相关，该位点的突变将导致启动子序列结合蛋白的改变。(3)通过启动子活性分析(luciferase reporter assay)、基因位点突变(site mutation)、染色体免疫沉淀(ChIP)、凝胶阻滞(EMSA)等方法，研究E2F家族成员E2Fl及E2F4对POLD1基因启动子的转录调控作用，结果表明E2Fl及E2F4可以促进POLDI基因启动子转录活性，E2F1及E2F4可以与POLD1基因启动子+27～+34的GCGGGAAA序列结合。(4)利用E2F元件突变型启动子，通过ChIP、共转染等实验，研究p21与E2F共同参与POLD1基因启动子的转录调控作用，结果表明p21可以抑制E2F对POLD1基因启动子的转录调控作用，p21对POLD1基因启动子的抑制作用依赖于E2F元件，p21高表达将导致E2Fl与POLD1基因启动子的结合减弱。(5)构建p21及E2F蛋白突变体，并利用Rb蛋白功能缺陷细胞系C33a，研究p21抑制E2F对POLD1基因启动子转录调控的机制，结果表明p21及E2F蛋白的部分功能突变没有影响其对POLD1基因启动子的转录调控作用。(6)利用RNAi，蛋白免疫荧光定位及UV损伤处理等方法，研究DNA聚合酶6调节亚基p50蛋白的功能，结果表明p50蛋白表达降低将导致细胞周期G2/M阻滞，而该现象可以被高表达的PCNA所回补；p50蛋白在UV损伤处理后表达水平增高，蛋白定位由胞质进入细胞核中。
结论：(1) CDE/CHR元件与POLDI基因启动子活性的细胞周期依赖性变化相关。(2)周期相关因子p21及E2F参与POLD1基因启动子转录调控，E2Fl及E2F4可以直接与POLD1基因启动子结合而促进其转录，p21对POLD1基因启动子的抑制作用依赖于E2F元件；(3)p21对POLD1基因启动子活性的抑制可能部分通过非依赖于Rb的途径完成；(4) p50蛋白降低表达并不能影响DNA复制过程，并且p50蛋白可能参与了DNA损伤修复过程。