氨基功能化磁性纳米粒子富集结合多重PCR检测食源性致病菌

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yanjiawei2005
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食品生产过程中可能受到多重病原菌的污染,对消费者的健康造成严重威胁,快速检测食品中的致病菌,对保障食品安全十分重要。然而食品中污染的病原菌通常数量较少,且食品成分中存在干扰性物质,影响检测方法的灵敏度及特异性,因此,对食品中致病菌进行分离或富集是十分重要的。磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)具有良好的生物相容性,而且容易分离,在食源性致病菌的分离和检测方面受到青睐。本研究制备一种带正电荷的氨基功能化磁性纳米粒子(Amino functionalized magnetic nanoparticles,AF-MNPs),与负电荷的细菌间静电相互作用,对细菌进行富集,结合多重PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。具体研究内容和结果总结如下。1)AF-MNPs的制备及表征。通过化学共沉淀法制备Fe3O4 MNPs,表面修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),合成了表面携带正电荷的AF-MNPs,并进行表征。结果表明制备的AF-MNPs呈球形或类球形,粒径约为10 nm,电镜下一定程度上有团聚现象,纳米粒度分析仪测定分散型指数(Polydispersity inde,PdI)为0.10±0.036,分散性良好,等电点在9.4左右,在pH 2-9其表面带正电荷。2)AF-MNPs富集食源性致病菌。AF-MNPs对细菌的吸附捕获主要是基于带正电荷的MNPs和带负电荷的细菌之间的静电相互作用。以S.aureus、L.monocytogenes、S.enteritidis和大肠杆菌(Escherichia coli)为目标菌株,研究AF-MNPs与细菌之间相互作用的影响因素,包括AF-MNPs、细菌和缓冲体系。结果表明,以100μg AF-MNPs与浓度为103 CFU/mL的细菌在PBS中温育60 min,对S.aureus、E.coli、L.monocytogenes的捕获率均高于97%,但对S.enteritidis的捕获率低于40%;在pH 5-9 PBS(10 mmol/L)中,AF-MNPs对S.aureus和E.coli的捕获率均大于80%,在pH 4-8 PBS(10 mmol/L)时,AF-MNPs对L.monocytogenes的捕获率均大于75%;在PBS浓度为5-30 mmol/L范围内对S.aureus,L.monocytogenes,E.coli的捕获率分别保持在75%、85%以及90%以上;在研究的4种细菌中,S.enteritidis的Zeta电位值最小,捕获率最低;100μg的AF-MNPs对细菌浓度在102-106 CFU/mL的范围内捕获率菌高于85%;在体积为10 mL的缓冲溶液中,对浓度为4 CFU/mL、40 CFU/mL和400 CFU/mL的细菌捕获率超过90%。人工污染牛奶中,AF-MNPs对S.aureus,E.coli,L.monocytogenes和S.enteritidis的最高捕获效率为分别为67.14%±1.33%、62.89%±0.68%、57.92%±2.93%和30.26%±0.69%;在人工污染的西瓜样品中,AF-MNPs对于S.aureus、L.monocytogenes、E.coli和S.enteritidis的最高捕获率分别为85.38%±0.63%、69.84%±2.97%、79.28%±0.90%和31.66%±3.30%。为了检验AF-MNPs的适用性,采集8种咸菜样品和6种卤肉样品,AF-MNPs对咸菜食品中细菌的捕获率均高于75%,对卤肉样品的捕获率均高于65%。3)AF-MNPs富集结合多重PCR检测食源性致病菌。以AF-MNPs富集结合多重PCR检测人工污染牛奶中的S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis。牛奶受到污染时,经AF-MNPs富集的人工污染牛奶样品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的灵敏度分别为2 CFU/mL、2×102 CFU/mL和2 CFU/mL。而未经AF-MNPs分别捕获富集的人工污染牛奶样品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的灵敏度分别为2×102 CFU/mL、2×103 CFU/mL和2×103CFU/mL。将三种食源性致病菌进行等浓度污染牛奶样品,经AF-MNPs富集结合多重PCR检测,对S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis的灵敏度为20CFU/mL、2×102 CFU/mL和2×102 CFU/mL,较直接进行多重PCR,灵敏度分别提高100或1000倍,因此,AF-MNPs富集可以减少食品成分对检测方法的干扰,有效提高多重PCR检测的灵敏度。
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