颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia,CCD)是一种少见的遗传性疾病,多为常染色体显性遗传,其致病基因定位于染色体6p21,并表明成骨细胞特异性转录因子(RUNX2/CBFA1/PEBP2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。国内有关CCD患者的致病基因突变报道较少,尚未涉及到基因突变对蛋白功能的影响以及相关的细胞学研究。本研究收集5个中国CCD家系,进行基因突变检测及相关功能研究,填补国内有关研究的空白;并利用收集到的标本进行牙齿组织学结构分析以及牙髓细胞培养,探究CCD牙髓细胞的生物学特性及基因表达差异,从一个全新的角度对CCD患者的发病机理进行探讨。本文内容共分为三部分,小结如下:一、颅骨锁骨发育不良综合征患者的临床检查与分析本部分主要是CCD相关病例的筛选、诊断,首先是对具有相关临床症状的先证者详细采集病史,明确单发或家族聚集倾向;利用X线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况;详细进行口腔检查,记录恒牙萌出及乳牙迟萌以及埋藏牙、多生牙等典型临床症状;综合上述临床资料,明确诊断。本研究中,五病例均具有明显的临床特征,比较典型的CCD特殊面容,口腔内表现为乳牙滞留,多数恒牙及多生牙埋伏于颌骨中不能萌出(除第4例没有明显多生牙外);均伴有锁骨发育不全,囟门闭合迟缓,身材矮小等症状。并发现一些新的临床畸形表现,如家系3先证者的尺、桡骨向桡侧偏斜致肱尺关节、肱桡关节畸形,肘外侧呈三角变形;家系2先证者的多生牙发生在磨牙区。利用收集的家系5先证者姐姐(CCD患者)的牙齿标本进行组织学分析,光镜及扫描电镜下观察牙齿磨片,发现恒牙牙冠釉质结构不清晰以及牙本质小管部分闭塞、管周牙本质矿化低,釉牙本质界缺乏典型的连续扇形结构;CCD乳前牙釉质厚度无明显变薄,釉板(或裂隙样)及釉丛结构较多,牙本质小管分布及大小不均,部分闭塞,并可见裂隙;观察CCD恒牙牙根上2/3纵磨片,发现牙骨质较薄,未见明确牙骨质细胞;对滞留乳牙进行观察,亦未发现细胞牙骨质。对CCD患牙以及正常牙的牙釉质以及牙本质分别进行能谱分析,数据用SPSS13.0版本进行处理,两样本均数t检验进行统计分析,结果表明CCD恒牙的牙釉质及牙本质的Ca、P含量均较正常降低,并具有统计学差异(t值分别为29.519、26.998以及9.676、88.982;p值分别为0.001、0.004以及0.011、0.003),CCD乳牙牙釉质的Ca、P含量均降低,并具有统计学差异(t值分别为33.754、23.412;p值分别为0.011、0.019),牙本质各元素的含量有降低,但无统计学差异,可能是样本量较少的原因。组织学分析与能谱分析均表明CCD患牙矿化较差,牙本质亦同样受累。本研究在组织学水平检测了RUNX2基因突变对CCD患者牙齿结构的影响,再次证明RUNX2基因对于牙齿正常发育的重要性。二、致病基因RUNX2的突变检测及对蛋白亚细胞定位的影响对五个CCD家系进行RUNX2基因突变分析发现:在五个CCD家系患者中均检测到不同的突变位点,家系中健康成员同一位点均为野生型序列,进一步证明RUNX2基因是CCD患者的致病基因,此基因的单倍体不足是CCD的致病原因。其中家系4的c.475 G＞C错义突变以及家系5的c.1096 G＞T无义突变是本研究检测到的新突变位点;家系2的c.673 C＞T以及家系3的c.1171C＞G突变位点在中国CCD患者中首次检出;家系1的c.674G＞A,R225Q是国外文献报道突变率最高的位点。本研究结果拓展了国内CCD基因层次的研究领域,为国内外CCD致病基因的突变位点数据库增添了新的资料。为了研究基因突变对蛋白突变体亚细胞定位的影响,通过构建真核表达载体,引入突变位点,转染细胞,观察pEGFP-C1-RUNX2载体转染组细胞的荧光蛋白表达情况,未引入突变位点的野生型RUNX2组仅在胞核内见到绿色荧光表达;引入突变位点c.674G＞A及c.673 C＞T的两组转染细胞,在胞浆及胞核内均可见绿色荧光。pCMV-HA-RUNX2载体转染组细胞,利用荧光免疫组化,引入c.475 G＞C(p G159R)突变组在胞浆胞核内均可见绿色荧光,而野生型仅在胞核内有绿色荧光表达,将转染细胞分离胞浆胞核蛋白进行Western blot检测,可见引入突变组的胞浆胞核成分均具有特异条带,而野生型仅胞核成分检测到特异条带。我们提出G159R对于RUNX2蛋白的核定位具有重要作用,推测G159可能是RUNX2基因新的核定位元件之一,为进一步蛋白结构方面的研究提供一定的实验依据。三、CCD患者牙髓细胞的生物学特性分析及基因差异研究本部分从家系5先证者姐姐的下恒牙中分离培养牙髓细胞,与正常牙髓细胞相比,CCD牙髓细胞比正常细胞略显丰满、扁平;描绘生长曲线来评价细胞的生长状态,正常牙髓细胞生长趋势高于CCD细胞,流式数据应用SPSS13.0版本进行处理,用了两样本均数t检验,t值分别为10.14、12.05,两组细胞的G1期及S期具有统计学显著差异,P值分别为0.001以及0.000,提示CCD细胞滞留在G1期的比例显著增多,CCD牙髓细胞从G1期到S期的过渡明显受阻。透射电镜观察发现CCD细胞粗面内质网扩张,胞质内可见大小不等的层板状小体,这是正常牙髓细胞所不具有的特殊表现,粗面内质网扩张并可见部分核糖体颗粒脱落,可能提示细胞蛋白合成能力的改变,较多层板状小体的出现可能与脂类的合成分泌相关。对CCD牙髓细胞进行矿化液诱导,虽然部分细胞出现细长单极胞浆突起,并呈复层生长,但直至培养7周仍无矿化结节形成,而正常牙髓细胞培养4周后开始有结节形成,表明CCD牙髓细胞的矿化能力减弱,可能提示此细胞向成牙本质样细胞分化能力的减弱,以及CCD患者牙髓组织损伤修复能力减弱。采用第二代功能分类基因芯片从细胞水平分析基因突变对TGF-β/BMP信号传导通路相关基因表达的影响,发现有18条基因上调,14条基因下调。通过对异常表达基因的分析,提示E 366X RUNX2突变体影响了TGF-β/BMP信号传导通路上的一些相关基因的调控,如Cdc25A、TGFβ2、Smad3、EVI1的表达下调,COL3A1、BMP2、4、7均表达上调,细胞的增殖和分化是由多基因多通路共同调控的,协同作用较强的某些基因将决定细胞最终的趋势和命运,推测TGFβ2、Smad3、EVI1的表达减弱与COL3A1上调表达的协同作用可能阻碍了CCD牙髓细胞向成牙本质细胞的分化趋势;根据R391X突变体的功能研究报道,推测E366X突变极可能影响RUNX2突变体和Smads的相互作用,阻抑BMP对细胞分化的作用,BMP2、4、7的上调表达可能是由于正常的信号通路受到影响,通过其它负反馈机制调控细胞的分化和增殖。