阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的以进行性记忆减退、认知障碍为特征的神经退行性疾病。其病理改变的主要特征是在大脑皮层和海马区等脑区的神经细胞内出现神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NTF)、细胞外出现大量的老年斑(senileplaques,SP)、以及神经元的大量死亡。NFT主要是由Tau蛋白过度磷酸化后形成的双螺旋纤维细丝(parhelical filament,PHF)形成。Tau蛋白主要在中枢和外周神经系统含量丰富,在神经元有表达,在轴突含量很高。Tau蛋白通过促进微管的形成,保持微管的稳定性而发挥重要生理功能,而tau蛋白若发生过磷酸化,则导致病理损伤。在AD患者脑中,最早发现的变化就是tau蛋白的过磷酸化。根据磷酸化状态、生物学活性和是否聚合成PHF,AD患者的脑中tau蛋白分为三种:PHF-tau、ADP-tau和AD-tau。由于tau蛋白的异常过磷酸化在AD病因学中的重要作用因而其机制被广泛研究。目前认为,Tau蛋白磷酸化程度是体内多种蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶脱磷酸化两种作用平衡的结果。因此,过度磷酸化可由于平衡机制的失衡如蛋白激酶作用过强或磷酸酶作用过弱。所有异常过磷酸化tau蛋白的磷酸化位点都发生于Ser/Thr残基,所以Ser/Thr磷酸酶(PP)可催化Tau蛋白脱磷酸基。哺乳动物的Ser/Thr磷酸酶有4种,即PP1、PP2A、PP2B和PP2C。冈田酸(Okadaic acid,OA)是一种海洋生物提取物,实验证实对PP2A具有抑制作用。体外研究表明,OA能使神经元微管相关蛋白Tau蛋白异常过度磷酸化,由此产生神经毒性作用,引起AD样的病理过程。我们前期的实验表明,OA能通过Tau蛋白过度磷酸化而导致神经元产生凋亡。因此,OA被广泛应用于AD模型的研究中。茶多酚(Tea polyphenol,TP)为茶叶中酚类物质的总称。由茶叶中提取,为灰白色粉状固体或结晶,具涩味,易溶于水,是一种很强的天然抗氧化剂,包含至少八种重要的儿茶素物质(EGCG,ECG,EGC,EC,GCG,GC,CG,C,),实验证实具有良好的保健功效。其结构上的酚羟基决定了茶多酚的抗氧化活性,酚羟基越多,抗氧化能力就越强。茶多酚的酚性羟基结构使其具有很强的捕获、清除自由基的能力和抗氧化功能,由此减少自由基对DNA损伤。研究发现,在培养的海马神经元中加入Aβ引起海马神经元的损伤,但如果将EGCG(茶多酚的主要成分)和Aβ一起培养则可显著减轻这种损伤,其机制可能与增加可溶性淀粉样前体蛋白(sAPP)的生成而抑制淀粉样变有关。sAPP转基因小鼠的体外实验也进一步证实了EGCG对AD的抵抗作用。利用PD的大鼠模型观察发现,6-OHDA诱导动物旋转的行为改变是时间依赖性的,茶多酚可以浓度和时间依赖性减轻6-OHDA诱导动物产生旋转行为,降低中脑和纹状体中ROS和NO含量、蛋白质结合硝基酪氨酸浓度、脂质过氧化程度,也同时降低iNOS和nNOS表达水平。茶多酚预处理可增加黑质致密部存活神经元,减少凋亡细胞和抗氧化水平。口服茶多酚可以有效保护脑组织免于6-OHDA损伤引起的神经细胞死亡,可能是通过ROS和NO的途径实现的其保护作用。本研究在前期研究即OA引起神经元损伤包括凋亡的基础上,拟观察茶多酚拮抗通过OA诱导Tau蛋白过度磷酸化所致的神经毒发挥的保护作用。实验分为两个部分,第一部分为茶多酚拮抗OA诱导原代皮层神经元毒性作用观察(包括cck-8检测和Calcein-AM染色);第二部分为茶多酚拮抗OA诱导原代皮层神经元凋亡的作用观察(包括caspase活性3检测和TUNEl染色)。第一章茶多酚拮抗冈田酸诱导皮层神经元损伤的作用观察本部分实验的目的是观察茶多酚拮抗OA诱导的原代皮层神经元的毒性作用。主要通过检测细胞活力包括cck-8细胞活力分析及Calcein-AM染色,观察茶多酚对OA引起的神经元损伤的保护作用。实验结果如下:1.原代神经元培养新生3天内的wistar大鼠,乙醚麻醉后,75%乙醇消毒,开颅,取脑,分离出大脑皮层,取皮层神经元进行培养,原代细胞呈贴壁生长24小时后,细胞完全贴壁,形成椭圆形芽孢状,周围有明显的光晕,细胞折光性好。加入阿糖胞苷,抑制胶质细胞生长,得到纯化的神经元。培养至12天细胞生长良好,胞浆透明,突起发育良好,加入干预药物处理细胞。2.OA诱导后原代培养皮层神经元的神经毒性作用形态观察对培养12天的皮层神经元加入OA(10 nM)作用24小时。倒置显微镜下观察显示:原代培养皮层神经元突起明显回缩,胞体折光性下降,甚至溶解成碎片,神经网络较正常组明显减少。提示OA对培养神经元具有明显毒性作用。3.TP拮抗OA诱导的皮层神经元毒性作用的观察3.1.cck-8细胞活力分析培养的神经元加入OA(10 nM)后,细胞活力从100%降低到45.41±3.72%(n=5,P＜0.05)。用5μg/ml和10μg/ml TP预处理组后,不能抑制OA引起的细胞活力的降低。而用15μg/ml和20μg/ml TP预处理组后,可以拮抗OA(10 nM)诱导的神经毒作用,使细胞活力由损伤后的45.41±3.72%升高到70.53±3.27%及79.34±4.36%(n=5,P＜0.05)。3.2 Calcein-AM染色分析应用Calcein-AM染色进行细胞活力分析结果显示,OA(10 nM)作用后使Calcein-AM染色的阳性细胞明显减少,说明有活力的细胞明显减少。预先应用5μg/ml和10μg/ml的茶多酚无明显的保护作用,15μg/ml的茶多酚有保护作用,20μg/ml茶多酚的保护作用明显增强,表现为Calcein-AM阳性染色的细胞数明显增加。上述结果提示:1.OA对培养的大鼠原代皮层神经元产生毒性作用,细胞活力降低包括cck-8水平降低及Calcein-AM染色的活细胞明显减少。2.茶多酚可以拮抗OA引起的神经毒发挥保护作用。第二章茶多酚拮抗冈田酸诱导皮层神经元凋亡的作用观察本部分实验是通过检测神经元凋亡(Caspase-3和TUNEl染色检测),观察茶多酚是否通过抑制OA诱导的原代皮层神经元的凋亡发挥神经保护作用,实验结果如下:1.原代神经元培养新生3天内的wistar大鼠,乙醚麻醉后,消毒,分离出大脑皮层,取皮层神经元进行培养,原代细胞呈贴壁生长,24小时后,细胞完全贴壁,形成椭圆形芽孢状,周围有明显的光晕,细胞折光性好。加入阿糖胞苷,抑制胶质细胞生长,得到纯化的神经元。培养至12天细胞生长良好,胞浆透明,突起发育良好,加入干预处理细胞。2.OA诱导的原代培养的皮层神经元凋亡的检测:2.1 Caspase-3检测:OA诱导原代皮层神经元产生凋亡,与对照组相比,OA组的Caspase-3活性可引起Caspase3活性由对照组的相对荧光活性1.000±0.000增加到1.6833±0.4141(n=5,P＜0.05)。2.2 TUNEL染色:TUNEL的荧光染色显示,OA诱导凋亡的细胞核呈均匀或不均匀“圆形”或“椭圆形”绿色荧光。OA(10 nM)诱导原代培养皮层神经元凋亡率51.25±3.16%,而对照组神经元凋亡率是6.27±0.35%,(n=5,P＜0.05)。3.茶多酚对OA诱导的原代培养神经元凋亡的保护作用:3.1 Caspase3活性检测:预先应用5μg/ml和10μg/ml的茶多酚不能明显抑制OA引起的Caspase3活性增加,其相对荧光活性是1.5657±0.1215和1.5022±0.1044(n=5,P＞0.05)。而15μg/ml和20μg/ml的茶多酚可以显著抑制OA引起的Caspase3活性增加,其相对荧光活性值由1.6833±0.4141降低为1.3192±0.2007和1.1596±0.2521(n=5,P＜0.05)。3.2 TUNEL染色:TUNEL的荧光染色结果显示,较低浓度的TP(5μg/ml和10μg/ml)处理后凋亡率分别为45.54±2.83%,39.81±2.72%,(n=5,P＞0.05),与OA组无统计学差异;而较高浓度的TP(15μg/ml和20μg/ml)处理后,神经元凋亡率分别是26.83±2.35%、17.50±1.47%,(n=5,P＜0.05),明显低于OA组。上述结果提示:1.OA可以诱导原代皮层神经元凋亡。2.茶多酚可以拮抗OA引起的原代皮层神经元凋亡,发挥保护作用。结论:1.OA对培养的大鼠原代皮层神经元产生毒性作用,细胞活力降低包括cck-8水平降低及Calcein-AM染色的活细胞明显减少。2.茶多酚可以拮抗OA引起的神经毒发挥保护作用。3.OA可以诱导原代皮层神经元凋亡。4.茶多酚可以拮抗OA引起的原代皮层神经元凋亡,发挥神经保护作用。