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目的:课题组前期发现transgelin-2是针刺抗哮喘靶标蛋白,并针对该靶标蛋白优化筛选出能与之结合且具有一定舒张气道平滑肌细胞功能的针刺抗哮喘活性小分子CAT12(Compound of acupuncture anti-asthmatic target 12)。本研究进一步围绕针刺抗哮喘活性小分子CAT12,在体外检测其对大鼠离体气管螺旋条张力的影响,在体内利用小鼠哮喘、气道高反应等多种模型检测其对气道阻力的影响,以期为下一步基于针刺抗哮喘效应的靶标药物发现提供坚实的实验基础。方法:1.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对大鼠离体气管螺旋条张力的影响将大鼠离体气管螺旋条固定在离体组织灌流系统,以1.5 g前负荷平衡1 h后,滴加终浓度为6.6×10-5 g/m L乙酰胆碱(ACh)刺激大鼠离体气管螺旋条,待张力值稳定(1.5 min)后分别加入生理盐水(NS)、阳性对照异丙肾上腺素(ISO,终浓度800 ng/m L)和CAT12(终浓度800 ng/m L),观察CAT12对大鼠离体气管螺旋条张力的影响。2.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对乙酰甲胆碱(Mch)诱导的小鼠气道高反应模型气道阻力的影响正常小鼠麻醉后进行气管插管,并与小动物肺功能仪连接,直接给予正常小鼠分别雾化吸入NS、阳性对照ISO(10μg/kg)、CAT12(100 ng/kg),雾化体积15μL,雾化时间2 min,适应时间5 min。上述药物雾化结束后再依次进行3、6、12、24、48 mg/m L Mch梯度攻击,利用小动物肺功能仪记录小鼠气道阻力的变化。3.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对动物抗原卵蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型气道阻力的影响给予小鼠腹腔注射0.2 m L OVA与Al(OH)3混合液致敏,14天后雾化吸入25μL 0.4%OVA激发哮喘。在激发前10 min分别雾化吸入NS、阳性对照特布他林(TB,10μg/kg)、CAT12(1、10、100 ng/kg)。雾化体积25μL,雾化时间2 min,并利用小动物肺功能仪记录给药后50 min内小鼠气道阻力的变化。4.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对人抗原屋尘螨(HDM)诱导的小鼠哮喘模型气道阻力的影响给予小鼠腹腔注射0.2 m L HDM与Al(OH)3混合液致敏,第14天将小鼠放到40cm×30cm×30cm密闭箱中雾化吸入HDM激发哮喘(浓度为3μg/m L,速率为2.5 m L/min,时间为30 min,雾化体积为15 m L),连续雾化7天后在第21天进行小鼠气道阻力检测。给予各组小鼠分别雾化吸入NS、阳性对照ISO(10μg/kg)、CAT12(1、10、100 ng/kg)后再依次进行1.5、3、6、12、24 mg/m L乙酰甲胆碱(Mch)梯度攻击,并利用小动物肺功能仪记录小鼠气道阻力的变化。结果:1.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对大鼠离体气管螺旋条张力的影响向浴槽中加入终浓度为6.6×10-5 g/m L的ACh后,大鼠气管螺旋条收缩达到最大值的70%左右。分别加入CAT12、ISO等小分子后发现,ISO组大鼠气管螺旋条1-10 min内张力值与模型组相比均显著降低(P<0.05),ISO组大鼠气管螺旋条张力值1-10 min之和与模型组相比显著降低(P<0.05),说明ISO作为阳性对照药物可舒张气管螺旋条。CAT12组与模型组相比,大鼠气管螺旋条张力值在第2-10 min内均显著降低(P<0.05),CAT12组与模型组相比大鼠气管螺旋条1-10 min张力值之和显著降低(P<0.05)。综上,CAT12具有舒张大鼠离体气管螺旋条的作用。2.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对乙酰甲胆碱诱导的小鼠气道高反应模型气道阻力的影响从气道内直接雾化给予正常小鼠3、6、12、24、48 mg/m L Mch,发现气道高反应模型组小鼠气道阻力随着Mch浓度升高逐渐增大,且与NS组相比差异具有显著性(P<0.05)。阳性对照ISO组小鼠气道阻力与模型组相比在48mg/m L Mch刺激下显著降低(P<0.05)。从前期预实验中获得CAT12降低气道阻力最佳浓度,进一步雾化吸入100 ng/kg CAT12可显著降低Mch诱导的小鼠气道高反应模型气道阻力,且与模型组相比在12、24、48 mg/m L Mch刺激下显著降低(P<0.05)。上述结果提示CAT12具有减少乙酰甲胆碱诱导的小鼠气道高反应模型气道阻力作用。3.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对动物抗原卵蛋白诱导的小鼠哮喘模型气道阻力的影响OVA激发后,模型组小鼠气道阻力显著升高,与NS组相比气道阻力增加了229%,差异具有统计学意义(P<0.05),提示OVA诱导的小鼠哮喘模型构建成功。阳性对照TB组小鼠气道阻力与模型组相比下降了31%,差异有统计学差异(P<0.05)。CAT12(1、10、100 ng/kg)雾化吸入后气道阻力分别减少了58%、64%、77%,对比模型组差异有统计学意义(P<0.05)。其中,100 ng/kg CAT12减少气道阻力效应最强,是TB(10μg/kg)的2.4倍。综上,CAT12具有减少OVA诱导的小鼠哮喘模型气道阻力的作用。4.针刺抗哮喘活性小分子CAT12对人抗原屋尘螨诱导的小鼠哮喘模型气道阻力的影响7天HDM反复激发后,模型组小鼠气道阻力对Mch反应性显著升高,其中在24 mg/m L Mch刺激下,模型组气道阻力为1267±68%,比对照组增长了2.3倍,提示HDM诱导的小鼠哮喘模型构建成功。ISO组气道阻力与模型组相比在24 mg/m L Mch刺激下显著降低(P<0.05)。1、10、100 ng/kg CAT12雾化吸入后气道阻力对比模型组分别减少了3%、18%、46%。其中10 ng/kg CAT12组小鼠气道阻力改变在24 mg/m L Mch刺激下显著降低(P<0.05),100ng/kg CAT12组小鼠气道阻力改变在12、24 mg/m L Mch刺激下显著降低(P<0.05)。100 ng/kg CAT12减少小鼠气道阻力的效应最好,比ISO(10μg/kg)高20%。综上,CAT12具有减少HDM诱导的小鼠哮喘模型气道阻力作用。结论:针刺抗哮喘活性小分子CAT12在体外具有良好的舒张气道平滑肌的作用,在体内具有良好的降低小鼠气道阻力的作用,可为基于针刺抗哮喘效应的靶标药物发现提供良好的体外、体内实验借鉴。