核盘菌弱毒相关病毒基因组分子生物学特性的初步研究

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本文对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)Ep-1PN菌株弱毒相关dsRNA进行了cDNA克隆,分析了该序列的结构特性,并与其它相近病毒的基因组进行了同源性比较,在分子水平上进一步探讨真菌病毒与核盘菌弱毒现象的关系。研究结果报道如下: 1 采用RT-PCR及cDNA克隆技术对弱毒菌株Ep-1PN的6.4kb dsRNA片段进行了cDNA克隆,得到了多个阳性克隆,通过序列测定及拼接,获得了该dsRNA基因组含有4629bp的核苷酸的序列,并已在GenBank登录注册(登录号为AY147260)。 2 4629bp的RNA序列中包含一个推定的不完整的阅读框架(ORF),编码含有1440个氨基酸残基的Helicase-RdRp融合蛋白,在已获得的核苷酸序列中没有发现编码病毒外壳蛋白性质的基因。 3 对核酸序列同源性进行比较(Blast)发现,核盘菌弱毒相关dsRNA序列与植物病毒Potexvirus组中的病毒有较高的同源性,这些植物病毒包括BaMV(Bamboo mosaic virus)、PVX(Potato vires X)、CIYMV(Clover yellow mosaic virus)和TuVX(Tulip virus X)等。对推定的Helicase和RdRp的氨基酸序列进行同源性比较也证实了核盘菌弱毒相关dsRNA与植物病毒有较高的同源性,而与典型的真菌病毒存在较大的差异。因此,我们推定弱毒菌株Ep-1PN感染了类似植物病毒的真菌病毒,并将其命名为核盘菌弱毒相关病毒,缩写为SsHV(S.sclerotiorum hypovirulence-associated virus)。 4 根据SsHV已知的核苷酸序列设计特异引物,对Ep-1PN及其恢复菌株进行RT-PCR,这些恢复菌株包括有性后代Ep-1PNAa、Ep-1PNAb、Ep-1PNAe,原生质体再生菌株Ep-1PNP14、Ep-1PNP94、Ep-1PNP131,以及单菌核分离物Ep-1PNSSB9。结果在原生质体再生菌株Ep-1PNP131和单菌核分离物Ep-1PNSSB9中均检测到相同的特异性扩增片段,大小为871bp,与前面所得到的Ep-1PN核苷酸序列大小相符。这两个菌株在表型上与核盘菌正常菌株相比具有一定的差异,属于部分恢复菌株。而在形态、生长速度及毒力恢复正常的另外两个原生质体再生菌株Ep-1PNP14、Ep-1PNP94及子囊孢子单孢分离物Ep-1PNAa、Ep-1PNAb、Ep-1PNAe中均没有扩增到特征性片段。结果表明,核盘菌在进行有性遗传时可能激活其体内某种未知的机制,摆脱弱毒相关真菌病毒的影响,通过原生质体再生技术也可获得不携带真菌病毒的核盘菌衍生后代。与Ep-1PN相比,采用常规dsRNA提取方法从Ep-1PNP94和Ep-1PNSSB9的菌丝样品中难以检测到dsRNA,据此可推定SsHV的浓度可能会影响核盘菌的表型。
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