论文部分内容阅读
目的:氟诱导的成骨细胞异常增殖和活化与氟骨症息息相关,但其机制尚未完全阐明。MicroRNAs（miRNAs）作为重要的表观遗传调控因子,参与骨代谢及细胞周期的调控。本研究在既往发现CyclinD1高表达参与氟暴露成骨细胞增殖活跃基础上,结合课题组前期miRNA测序结果,进一步探讨miR-486-3p对CyclinD1的调控机制及其在氟诱导的成骨细胞增殖活化中的作用,为miRNA在氟骨症防治中的应用提供新思路。方法:1.miR-486-3p与CyclinD1、TGF-β1在燃煤污染型氟暴露人群的表达及相关性分析:依据地方性氟中毒病区划分标准（GB 17018-2011）,在贵州省燃煤污染型氟中毒病区毕节市织金县荷花村及非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村选择调查对象。依据调查对象纳入、排除标准,追踪既往调查对象共248例,知情同意原则下取其血样及尿样,课题组前期通过氟离子选择电极法测定调查人群体内氟负荷并进行分组,根据测定的尿氟浓度（UF）,将调查对象分为三组:（1）UF<1.96mg/g Cr,117例;（2）1.96 mg/g Cr≤UF<3.92 mg/g Cr,65例;（3）UF>3.92 mg/g Cr,66例。使用miRWalk3.0数据库的四种不同算法（miRDB、miRWalk、Target Scan和miRTar Base）预测靶向CyclinD1的miRNA,结合课题组前期的miRNA-seq结果和筛选标准,预测出氟暴露人群中表达下调且靶向调控CyclinD1的miRNAs,包括miR-4755-5p,let-7c-5p和miR-486-3p。生物信息学分析显示miR-486-3p还靶向TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1,本论文选择miR-486-3p进一步研究。在课题组前期检测血清中碱性磷酸酶活性（ALP）和骨钙素（BGP）含量、外周血单个核细胞（PBMCs）中CyclinD1表达的基础上。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证调查对象血浆中miR-486-3p表达;qRT-PCR、ELISA法检测PBMCs中TGF-β1mRNA转录及血浆中TGF-β1蛋白表达;Spearman相关性分析评估外周血中miR-486-3p和CyclinD1、TGF-β1之间的相关性。2.氟对miR-486-3p、CyclinD1、TGF-β1/Smad2/3/CyclinD1轴的影响:酶消法分离人原代成骨细胞,通过形态学观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。根据课题组前期实验及预实验结果以0、600、1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h进行后续试验。qRT-PCR检测miR-486-3p、CyclinD1及TGF-β1 mRNA转录;免疫印迹法（Western blotting）检测CyclinD1、TGF-β1表达和核内外Smad2/3表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光检测Smad2/3入核情况;染色质免疫共沉淀法（ChIP）法检测Smad2/3在CyclinD1转录调控区富集情况。3.miR-486-3p调控CyclinD1参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化机制研究:（1）miR-486-3p参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化:在课题组前期证实氟诱导人原代成骨细胞增殖活化的基础上,采用miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后进一步用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h。qRT-PCR检测miR-486-3p表达;使用CCK-8、Ed U、流式细胞术、ALP活性和BGP含量检测miR-486-3p对成骨细胞增殖活化的影响。（2）miR-486-3p可直接靶向CyclinD1在转录后水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后,使用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,qRT-PCR检测CyclinD1 mRNA转录,Western blotting检测CyclinD1蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-486-3p与CyclinD1的靶标关系。（3）miR-486-3p可通过TGF-β1/Smad2/3通路在转录水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。双荧光素酶报告基因实验验证miR-486-3p与TGF-β1的靶标关系。采用miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后进一步采用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,qRT-PCR检测TGF-β1 mRNA转录,Western blotting检测TGF-β1蛋白表达、核内外Smad2/3表达及磷酸化水平,细胞免疫荧光检测Smad2/3入核情况,以及ChIP检测Smad2/3在CyclinD1转录调控区富集情况。4.248例调查对象CyclinD1表达与相关miRNAs的多重线性回归分析:在248例调查对象中,分别以CyclinD1 mRNA、蛋白表达为因变量,以miR-4755-5p表达水平,let-7c-5p表达水平和miR-486-3p表达水平作为自变量进行多重线性回归分析（逐步回归法）。结果:1.基于课题组前期miRNA-seq结果和筛选标准,利用生物信息学软件在下调的miRNA中筛选出靶向CyclinD1和TGF-β1的miR-486-3p进行后续实验。结果显示在燃煤型氟暴露人群中,与低尿氟组比较,高尿氟组血浆中miR-486-3p表达降低（P<0.05）,PBMCs中TGF-β1 mRNA转录及血浆中TGF-β1蛋白表达增加（P均<0.05）。同时,研究对象miR-486-3p水平与CyclinD1、TGF-β1表达呈负相关（P均<0.05）,提示miR-486-3p可能参与了CyclinD1和TGF-β1的上调。2.在氟化钠处理的人成骨细胞体外实验中,随着染氟剂量的增加,miR-486-3p表达逐渐降低（P<0.05）,CyclinD1、TGF-β1 mRNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）;胞内磷酸化Smad2/3蛋白表达上调并向核转移,且Smad2/3与CyclinD1转录调控区结合增加,差异有统计学意义（P均<0.05）。表明NaF可下调miR-486-3p但上调CyclinD1的表达,且NaF可活化TGF-β1/Smad2/3/CyclinD1轴。3.NaF作用下,转染miR-486-3p mimic的成骨细胞与只经1200μmol/L NaF处理的成骨细胞相比:（1）miR-486-3p的表达升高（P<0.05）,人成骨细胞增殖活跃受抑制、细胞周期进程受阻,ALP活力及BGP含量降低（P均<0.05）。表明NaF作用下,miR-486-3p的过表达可逆转氟诱导的成骨细胞增殖活化。（2）CyclinD1mRNA转录与蛋白表达降低（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果证实miR-486-3p与CyclinD1 3’-UTR存在靶标关系（P<0.05）。表明miR-486-3p可直接靶向CyclinD1在转录后水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。（3）双荧光素酶报告基因实验结果证实miR-486-3p与TGF-β1 3’-UTR存在靶标关系（P<0.05）。TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的表达降低,Smad2/3蛋白的核转位减少,Smad2/3与CyclinD1转录调控区的直接结合受抑制,差异均具有统计学意义（P均<0.05）。即miR-486-3p过表达逆转了NaF诱导的TGF-β1/Smad2/3/CyclinD1轴的活化,表明miR-486-3p可通过TGF-β1/Smad2/3通路在转录水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。4.多重线性回归分析结果显示248例调查对象外周血中CyclinD1表达与miR-4755-5p、let-7c-5p和miR-486-3p表达水平呈负线性回归关系,并提示三个miRNA中对CyclinD1 mRNA、蛋白表达影响最大的是miR-486-3p。结论:miR-486-3p直接靶向CyclinD1在转录后水平和通过TGF-β1/Smad2/3信号通路在转录水平调控CyclinD1表达,进而参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化。