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牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine herpesvirusⅠ,BHV-1）又称为牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV）,是导致牛传染性鼻气管炎（Bovine infectious rhinotracheitis,IBR）的病原。BICP0作为BHV-1的毒力蛋白在BHV-1的整个感染期都能持续性表达。大量的研究表明,BICP0的表达是导致BHV-1复苏及大量增殖的重要病因。TRAF6作为宿主体内多个天然免疫通路中的关键接头分子,能够介导NF-κB信号通路（经典通路和非经典通路）、MAPK通路（JNK1/2、ERK1/2、p38）、IRFs通路（IRF3、IRF4、IRF5和IRF7）以及PI3K通路,在宿主的炎症反应和天然抗病毒反应等方面发挥至关重要的作用。本研究通过对BICP0与TRAF6之间的相互作用机制和作用的结构基础进行研究,进一步地了解了BHV-1利用BICP0进行的免疫逃避机制,为BHV-1的防治提供理论支持和物质基础,主要的研究内容有如下几个方面:1.BICP0基因的扩增及重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的构建本研究以Gen Bank中BHV-1.1 Cooper毒株（USDA NVSL challenge 97-11）的序列信息（Gen Bank accession number:JX898220）为参考依据设计PCR引物对,以实验室保存的BHV-1毒株所制备的基因组为扩增模板进行PCR扩增。本研究成功获得BICP0的基因片段并构建了p EASY-Blunt Simple-BICP0重组质粒。随后通过使用商品化的Multi Bac Mam?系统,成功构建了重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG。作为有效的外源基因投递系统,重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG成功解决了MDBK细胞难以转染的问题,其通过在MDBK细胞中投递BICP0基因为独立研究BICP0的功能奠定了物质基础。另外,本研究在BICP0的羧基端引入了Flag标签序列,简化了BICP0的鉴定工作,为后续研究的顺利进行奠定了基础。2.重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的应用通过Reed-Muench法测得P3代RE-BICP0-FLAG的病毒滴度为2.7×106TCID50/100μL。利用梯度感染试验和Western Blot方法鉴定,确定了RE-BICP0-FLAG转导MDBK细胞的最佳使用剂量为1×106TCID50至2×106TCID50。随后通过对RE-BICP0-FLAG转导的MDBK进行荧光定量PCR鉴定,发现BICP0会降低IL-6、IL-8、ISG15和ISG56的转录水平,提示BICP0可能对MDBK细胞的炎症通路和抗病毒通路存在抑制作用。Western Blot鉴定结果表明BICP0会在蛋白水平导致TRAF6的减少。通过分别使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯奎,本研究发现BICP0在MDBK细胞中导致的TRAF6减少是经由泛素-蛋白酶体途径而降解的。RE-BICP0-FLAG的成功应用,使本研究初步确认了BICP0在无其它病毒蛋白参与的情况下,可以通过水解宿主天然免疫相关分子——TRAF6实现免疫逃避的功能。3.BICP0对TRAF6的干扰作用研究为进一步研究BICP0对TRAF6的作用机制,构建了数个BICP0的重组表达载体:pc DNA3.1-BICP0-Flag、pc DNA3.1-△BICP0-Myc和pc DNA3.1-BICP0-Flag（13A/51A）。同时以牛肝组织中的c DNA为模板扩增了牛TRAF6基因,并成功构建了重组表达载体:pc DNA3.1-TRAF6-HA和pc DNA3.1-C71A-HA。利用瞬时转染的方式将上述质粒投递至HEK293T细胞中,一方面通过双荧光素酶活性检测方法对NF-κB启动子和IFNβ启动子的激活情况进行评估,结果表明BICP0能够抑制TRAF6对NF-κB启动子和IFNβ启动子的激活。另一方面,Western Blot鉴定结果表明在HEK293T中瞬时表达的BICP0也能发挥降解TRAF6的作用,并且这种作用可被BICP0的si RNA所抑制。更进一步的鉴定结果表明,BICP0氨基端的RING finger结构域具有的E3泛素连接酶活性是必不可少的,而羧基端（357-637aa）并不是其功能发挥所必需的。4.BICP0对TRAF6的修饰类型研究利用免疫沉淀技术将HEK293T细胞中瞬时表达的TRAF6-HA蛋白从全细胞裂解液中进行分离和纯化,应用Western Blot方法对TRAF6-HA蛋白进行鉴定。兔抗HA抗体的检测结果表明,BICP0存在对TRAF6的修饰作用。通过使用兔抗Ub抗体进行鉴定,确定了修饰作用为泛素化修饰。最后通过能特异性识别泛素链类型的兔抗K48-Ubiquitin抗体和兔抗K63-Ubiquitin抗体,明确了BICP0能促进TRAF6被K48连接形式的泛素链修饰。5.BICP0中关键氨基酸的鉴定利用免疫共沉淀方法对BICP0和TRAF6之间的相互作用进行鉴定,结果表明两者存在蛋白间的相互结合并且只有BICP0氨基端的1-356aa参与上述作用。随后通过构建BICP0的“346-PAERQY-351”基序突变体进行后续鉴定,Western Blot结果表明BICP0的“346-PAERQY-351”基序是其与TRAF6相互作用的结合部位,并且第351位的酪氨酸（Y351）是关键氨基酸。间接免疫荧光结果表明,BICP0会与TRAF6在细胞核中共定位,而Y351A突变体则未能观察到上述现象。双荧光素酶活性检测结果表明,Y351A突变体对TRAF6激活启动子的抑制作用也出现下降。6.BICP0抑制TRAF6对IRF7的激活通过双荧光素酶活性检测发现,BICP0能够抑制TRAF6和IRF7蛋白对IFNβ启动子的共激活。Western Blot结果表明BICP0抑制了TRAF6对IRF7的K63连接形式的泛素化修饰。本研究证明了BICP0能够通过负调控TRAF6从而发挥免疫逃避的功能,并较为深入地研究了BICP0与TRAF6之间相互作用的机制,进而发现了BICP0和TRAF6之间发生结合的结构基础。本研究成果能够为进一步探究BHV-1的免疫逃避机制提供理论支持,同时可为新型疫苗的研发提供理论依据和技术支持,并为深入研究BHV-1逃避宿主固有抗病毒免疫机饿制提供物质基础与技术平台。