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研究背景年龄相关的雄激素水平下降与多种神经退行性疾病相关,包括阿尔茨海默病海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、焦虑抑郁症、脑萎缩等。越来越多资料提示,双氢睾酮(Dihydrotestosterone, DHT)在此类疾病的预防与治疗中具有广泛的神经生物学作用,有助于抑制疾病病理损伤、修复损伤的神经元、突触可塑性修复等神经保护效应。目前关于雄激素神经保护作用机制研究较少,主要包括： (1)调节脑内β-淀粉样蛋白释放； (2)抗氧化应激： (3)抗凋亡作用；(4)促进神经元生长、分化。进一步阐明雄激素的神经保护作用及其分子作用机制,可能为我们探索预防与治疗神经退行性疾病的新方法提供非常重要的理论与临床依据。研究目的本研究采用C6细胞作为体外神经胶质细胞研究模型,利用U18666A诱发C6细胞凋亡活动、LY294002抑制PI3K/Akt信号通路,观察PI3K/Akt信号通路在双氢睾酮(DHT)抗U18666A诱导的C6细胞凋亡活动的作用及其分子机制。从而进一步探讨PI3K/Akt信号通路在雄激素抗U18666A诱发C6细胞凋亡作用中的意义。研究方法第一部分通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术、Hochest33342染色检测法,分别定量和定性检测不同浓度的U18666A对C6细胞凋亡活动的形态学变化影响。第二部分通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术、Hochest33342染色检测法从形态学上观察DHT对U18666A诱导C6细胞凋亡的保护作用,以及LY294002对DHT凋亡保护的阻断作用。第三部分利用Western Blot检测法,观察DHT对Akt磷酸化激活作用,以及LY294002对DHT的Akt磷酸化激活作用的影响。此外,我们还进一步利用Western Blot检测法定量观察DHT、LY294002对凋亡相关蛋白Seladin-1、Bcl-2家族、IAP家族、Caspase-3表达变化的影响,探讨PI3K/Akt信号通路及其下游凋亡相关分子Seladin-1、BCL-XL、Bax、Survivin、Caspase-3表达的变化在雄激素抗U18666A凋亡作用中的分子机制。研究结果第一部分免疫荧光检测发现,在荧光显微镜微镜下发现U18666A能显著诱导C6细胞凋亡发生,凋亡细胞数量明显增加。通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术定量检测发现,相较空白对照组,不同浓度(0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.5μg/ml)的U18666A处理能够显著增加C6细胞的总凋亡率(P<0.05)。上述结果提示,不同浓度的U18666A(实验采用)能够显著诱导C6胶质细胞发生凋亡活动。第二部分为了观察DHT对U18666A诱导C6胶质细胞亡活动的形态学影响,我们用DHT(10-2μM)预处理1h后给予U18666A(1.0μg/ml)刺激48h,在荧光显微镜下发现C6细胞凋亡细胞数量明显减少,而P13K抑制剂LY294002(50 μM)预处理2h后发现DHT的抗凋亡作用明显被抑制。此外,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞检测发现,与U18666A处理组相比,DHT预处理可以明显降低U18666A诱导的C6细胞总凋亡率(P<0.05),而P13K抑制剂LY294002(50μM)可以抑制DHT的抗凋亡活动(P<0.05)。上述结果提示,DHT可以明显阻断U18666A诱导的C6细胞凋亡活动,而P13K阻断剂可以明显抑制DHT的抗凋亡保护作用。第三部分首先我们利用Western Blot检测发现,与U18666A处理组比较,DHT处理后C6细胞的磷酸化Akt表达量显著升高(P<0.05),而LY294002预处理后能够显著抑制调DHT诱导的磷酸化Akt水平升高(P<0.05)。上述结果提示,DHT可以明显激活C6细胞的Akt磷酸化活动,而P13K阻断剂可以明显抑制DHT的Akt激活效应。此外,我们进一步利用Western Blot检测发现：1)与空白组比较,U18666A可以明显下调凋亡保护蛋白Seladin-1表达(P<0.05),上调促凋亡蛋白Caspase-3表达(P<0.05)：2)与U18666A处理组对比发现,DHT预处理后可以明显上调凋亡保护蛋白Seladin-1、Survivin、BCL-XL表达(P<0.05),下调促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达(P<0.05)。3)与DHT处理组(DHT+U18666A)比较,P13K阻断剂LY294002可以明显抑制DHT诱导的促凋亡蛋白Caspase-3、Bax下调表达(P<0.05),以及抑制DHT诱导的Seladin-1、Survivin、BCL-XL上调表达(P<0.05)。研究结论根据上述实验结果,在C6细胞模型上,我们发现：1)从凋亡形态学上我们发现,不同浓度的U18666A均可以明显诱导体外培养的C6细胞发生凋亡现象。上述结果提示,U18666A对C6胶质细胞具有促凋亡作用。2)从凋亡形态学上我们发现,DHT具有明显的抗U18666A诱导的C6细胞凋亡效应,而P13K抑制剂LY294002可以明显阻断DHT抗凋亡保护作用,我们的结果证明,PI3K/Akt信号通路参与了DHT抗U18666A诱导的C6细胞凋亡效应作用。3)此外,我们发现DHT可以显著上调凋亡保护蛋白Seladin-1、BCL-XL、 Survivin表达,下调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达发挥抗凋亡保护作用,而DHT上述效应可以明显被P13K抑制剂LY294002所阻断。因此,我们推测DHT可能通过激活PI3K/Akt信号通路调控下游的凋亡相关蛋白Seladin-1、Survivin、Caspase-3、BCL-XL、Bax表达,从而发挥抗凋亡保护作用。